王攀，彭菊琴，陳瀟瀟，劉哲，高云霄，劉建勛，任鈞國

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)為糖尿病心血管并發(fā)癥，其發(fā)病機制復雜，其中炎性反應與其關系密切。高血糖可誘導多種炎性因子生成與釋放，如核因子-κB和炎性小體[1-2]。據(jù)報道，高血糖會激活NLRP3炎性小體，從而促進pro-Caspase-1裂解為Caspase-1，裂解的Caspase-1一方面將白介素-1β前體(pro-interleukin-1β，pro-IL-1β)和白介素-18前體(pro-interleukin-18，pro-IL-18)轉化為成熟的IL-1β和IL-18[3]；另一方面切割消皮素D(GSDMD)的N端序列，促使大量成熟的IL-1β、IL-18釋放到胞外，募集炎性細胞，擴大炎性反應，誘發(fā)細胞焦亡[4-5]。此外，炎性小體的激活和細胞因子的釋放可促進膠原蛋白沉積和纖維化形成，進一步加劇DCM的嚴重程度[6]。因此尋找針對心肌細胞焦亡的有效藥物，可以緩解DCM的進程。尼可地爾是一種已被確認具有臨床意義的抗心絞痛藥物，通過促進NO的釋放和KATP通道開放引起血管舒張，增加冠狀動脈血流量，減少血管痙攣，改善心功能[7-9]。最近的研究表明，尼可地爾可通過抑制心肌梗死大鼠細胞焦亡來減輕心肌損傷[10]，但其是否能減輕DCM心肌細胞焦亡尚未見報道。現(xiàn)探討尼可地爾對DCM大鼠心功能的保護作用及潛在的分子機制，為DCM的治療提供更多的科學依據(jù)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：健康雄性Wistar大鼠，8周齡，體質量180～220 g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，許可證號 SCXK(京)2019-0010。動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院實驗動物中心，溫度 20～26℃，濕度 40%～70%，明暗12 h交替，自由攝食攝水。(2)藥物及試劑：尼可地爾片(中外制藥株式會社)，鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，檸檬酸、檸檬酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)，大鼠IL-1β、IL-18檢測試劑盒(FANKEW公司)，Anti-NLRP3 抗體、Anti-Caspase-1 抗體、Anti-GSDMD 抗體(abcam公司)，羊抗兔IgG H&L抗體(Bioss公司)，RIPA蛋白裂解液、脫脂奶粉(雅酶公司)，BCA蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所公司)，PMSF、ECL Plus超敏發(fā)光液(Solarbio公司)。(3)儀器設備：高分辨率小動物超聲儀(加拿大VisualSonics公司，型號Vevo 2100)，高速冷凍離心機(Thermo公司，型號IEC CL31R)，酶標儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS公司，型號352)，超聲破碎儀(美國Sonics公司，型號VCX130)，化學發(fā)光儀(六一電器公司，型號WD-9423C)，奧林帕斯顯微鏡(日本奧林帕斯公司，型號BX51)。

1.2 造模與分組 2020年10月—2021年1月在中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎醫(yī)學研究所進行實驗，本研究經(jīng)中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院倫理委員會批準(2021XLC001-2)。24只健康Wistar大鼠隨機選取8只常規(guī)飼料喂養(yǎng)(正常組)；余16只給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)(高糖高脂飼料：蔗糖10 % 、豬油10 %、膽固醇2.5 %、膽酸鈉1 % 、普通飼料76.5 %)，6周后，禁食不禁水10 h，腹腔注射STZ 30 mg/kg (用pH 4.2～4.5的枸櫞酸緩沖溶液配制，現(xiàn)用現(xiàn)配)，正常組注射同體積的枸櫞酸緩沖溶液；注射 STZ 72 h后尾靜脈采血測血糖，以空腹血糖≥16.7 mmo/L的大鼠為糖尿病模型復制成功，16只成模大鼠隨機分為模型組8只、尼可地爾組(5 mg/kg)8只，繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)，4周后開始給藥，照尼可地爾組按照1 ml/100 g灌胃給藥，正常組、模型組給予同體積的蒸餾水，每天灌胃1次，連續(xù)4周，第14周后實驗結束，進行相關指標檢測。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 心功能測定：實驗結束后，各組大鼠采用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，胸部剃毛，仰臥位固定。當大鼠心率穩(wěn)定時開始檢測，以高頻探頭定位，在左心室長軸及胸骨旁短軸各切面應用M模式超聲心動圖觀察心臟運動，選用左心室長軸切面計算左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)、每搏輸出量(stroke volume，SV)，各項指標均選取連續(xù)3個心動周期測量值的平均值。

1.3.2 心肌組織形態(tài)學觀察：每組隨機選6只大鼠取心臟, 用預冷的等滲生理鹽水洗凈血跡，濾紙吸干，各取1塊約3 mm3大小的左心室組織置于10% 中性福爾馬林中固定，石蠟包埋，切片(4 μm)，HE染色，脫水封片，顯微鏡下觀察小鼠心肌組織的形態(tài)改變。

1.3.3 心肌纖維化程度測定：每組取6個石蠟包埋好的心肌組織切片(4 μm)，經(jīng)Masson染色，脫水封片。顯微鏡下觀察小鼠心肌纖維化變化。采用圖像分析軟件Image-J 1.51統(tǒng)計膠原容積分數(shù)，膠原容積分數(shù)(%)=膠原陽性的藍色面積/視野總面積×100%。

1.3.4 心肌組織NLRP3、Caspase-1蛋白表達測定：每組隨機選3只大鼠各取左心室組織約50 mg置于冷凍管中，-80℃冰箱保存。檢測時取出樣本，冰上解凍后，加 RIPA裂解液(含PMSF)提取總蛋白，4℃，用超聲破碎儀破碎組織，離心吸取上清，采用BCA法測定蛋白濃度并進行蛋白定量。然后制膠(10%分離膠，5 %濃縮膠)、上樣(每樣品孔上樣30 μg總蛋白)、電泳、轉膜、5 %脫脂奶粉封閉(室溫輕搖60 min)，5 %牛奶-TBST稀釋一抗NLRP3、Caspase-1、GAPDH(1∶1 000，室溫孵育15 min)，4℃搖床過夜。第二天5 %牛奶-TBST稀釋二抗(1∶1 000，室溫輕搖60 min)，TBST洗膜，ECL曝光并用化學發(fā)光儀拍攝照片。運用Image J 1.51軟件分析條帶，以目標蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值表示目標蛋白的相對表達量。

1.3.5 心肌組織GSDMD蛋白表達測定：每組取6個石蠟包埋好的心肌組織切片(4 μm)，乙醇梯度脫蠟，抗原修復，10%BSA室溫封閉1 h，滴加PBS稀釋好的一抗GSDMD(1∶1 000)，4℃孵育過夜，加入生物素標記的二抗，室溫孵育1 h，DAB 顯色，蘇木素復染30 s，流水沖洗5 min，脫水封片，顯微鏡下觀察并拍照，GSDMD蛋白陽性表達為棕色。采用Image J 1.51軟件計算GSDMD蛋白表達的積分光密度值(IOD)，用IOD表示GSDMD蛋白的表達水平。

1.3.6 血清IL-1β、IL-18水平測定：實驗結束后，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，室溫靜置2 h后離心取上清，采用ELISA法檢測血清IL-1β、IL-18水平，具體方法參照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1 各組大鼠心功能比較 與正常組比較，模型組大鼠LVEF、FS、SV均降低(P<0.05)；與模型組比較，尼可地爾組大鼠LVEF、SV均升高(P<0.05)，F(xiàn)S差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠心功能比較

2.2 各組大鼠心肌組織形態(tài)學比較 正常組大鼠心肌結構完整，肌纖維排列整齊，形態(tài)正常，間質未見充血、出血，未見明顯炎細胞浸潤；模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，肌間隔增寬，灶性水腫變性，間質充血、出血，中等量炎細胞浸潤；尼可地爾組大鼠心肌纖維排列較規(guī)整，纖維束間隔增寬不明顯，心肌細胞水腫變性偶見，間質輕度充血、水腫，少量炎細胞浸潤，見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學比較(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠心肌纖維化程度比較 正常組大鼠心肌纖維束排列整齊，無膠原纖維沉積；模型組大鼠心肌纖維束排列不規(guī)則，且存在大量膠原纖維沉積；尼可地爾組大鼠心肌纖維束排列明顯改善，膠原纖維沉積顯著降低，心肌纖維化明顯減輕，見圖2。與正常組(12.83±3.97)%比較，模型組膠原容積分數(shù)(30.00±7.62)%升高(t/P=4.896/0.001)；與模型組比較，尼可地爾組膠原容積分數(shù)(21.67±5.57)%降低(t/P=2.163/0.036)。

圖2 各組大鼠心肌纖維化程度比較(Masson染色，×200)

2.4 各組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，尼可地爾組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達水平均降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1 、GSDMD蛋白表達水平比較

2.5 各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-18水平升高(P<0.01)；與模型組比較，尼可地爾組大鼠血清IL-1β、IL-18水平降低(P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-18水平比較

3 討 論

DCM為糖尿病心血管并發(fā)癥，其特征是在沒有高血壓、冠狀動脈疾病和其他心臟病情況下的結構異常和功能障礙，主要體現(xiàn)在心肌纖維化、心肌肥厚、舒張功能或收縮功能障礙等[11-12]。目前，DCM是糖尿病所有并發(fā)癥中死亡的主要原因[13]，其發(fā)病機制復雜，尚未明確。本研究采用高糖高脂飼料聯(lián)合腹腔注射STZ的方法建立DCM大鼠模型，通過焦亡相關信號通路NLRP3/Caspase-1來探討尼可地爾對DCM大鼠心功能的影響及潛在機制。本結果顯示，模型組大鼠表現(xiàn)出心肌細胞水腫、心肌纖維化明顯及心功能低下特點，符合DCM的主要特征，并與文獻中DCM大鼠模型(模型建立方法與本研究相同)的表現(xiàn)一致[14-15]，提示該模型建立成功。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，尼可地爾對DCM有重要的保護作用，可通過抑制DCM心臟纖維化和凋亡直接緩解心臟重構，改善心功能，此外還能促進eNOS活性，釋放NO，其機制與激活PI3K/Akt通路有關。

本研究中，給予尼可地爾后，DCM大鼠心肌細胞水腫減輕，炎性細胞浸潤面積、心肌纖維化面積減少，且心功能(LVEF、SV)明顯升高，提示尼可地爾有效改善了DCM大鼠的心肌重構及心功能。

DCM期間心肌細胞的終末途徑是細胞死亡，因此抑制細胞死亡信號通路顯然是DCM的潛在治療靶點。在形態(tài)學上，細胞死亡可分為4種不同的形式，包括凋亡、自噬、壞死和吞并。此外，還存在一些其他類型的細胞死亡，如鐵死亡、溶酶體依賴性細胞死亡等，這些可能都與DCM相關[17]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，焦亡是程序性壞死的一種新形式，與細胞凋亡不同，其本質是細胞的炎性反應性死亡，是心肌細胞丟失的機制之一[18]。細胞焦亡的特征是孔隙形成、質膜破裂和細胞腫脹[19]。據(jù)報道，細胞焦亡參與了DCM的發(fā)展[20-21]，在高糖刺激下，炎性小體NLRP3激活，進而促進pro-Caspase-1裂解，裂解的Caspase-1一方面促進炎性因子前體pro-IL-1β和pro-IL-18轉化為成熟的IL-1β和IL-18，另一方面切割GSDMD的N端序列，促進細胞裂解，釋放大量成熟的IL-1β、IL-18，誘發(fā)細胞焦亡[3-5]。本研究結果顯示，模型組大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達水平明顯高于正常組，且血清IL-1β、IL-18也明顯高于正常組，再次證實與炎性反應相關的細胞焦亡參與了糖尿病誘導心臟損傷的發(fā)病機制[20-21]。尼可地爾作為常用的抗心絞痛藥物，可以對冠狀動脈產(chǎn)生積極的擴張作用、增加血流量、抑制冠狀動脈痙攣，減輕心絞痛，還能對部分瀕死的心肌進行挽救，降低心血管事件的發(fā)生[8-9]，但其是否能通過抑制DCM細胞焦亡來減輕心臟損傷尚未報道。本研究結果顯示，給予尼可地爾干預后，DCM大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達水平明顯降低，且血清中IL-1β、IL-18水平也明顯降低，提示尼可地爾可能通過抑制焦亡信號通路NLRP3/Caspase-1來減輕DCM心臟損傷。

綜上所述，尼可地爾可能通過抑制焦亡相關信號通路NLRP3/Caspase-1來抑制炎性因子的釋放，進而抑制心肌重構和心肌纖維化，改善心功能。本研究為豐富DCM細胞死亡的研究及未來DCM新的療法奠定了基礎。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

王攀：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫及修改；彭菊琴、陳瀟瀟、劉哲：實施研究過程，資料搜集整理；高云霄：進行統(tǒng)計學分析；劉建勛：論文修改；任鈞國：設計研究方案，提出研究思路，論文審核