張艷彬，陳文昆，周寅，張小娟，李魁星

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)是一種具有惡性增殖性、高度異質(zhì)性的淋巴系統(tǒng)腫瘤，多采用放療、化療治療，雖可使部分患者獲得長期生存，但難以徹底清除腫瘤細(xì)胞，且治療期間易損傷機(jī)體正常細(xì)胞，產(chǎn)生化療相關(guān)間質(zhì)性肺炎(interstitial pneumonia，IP)等諸多毒副作用[1-2]。嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)作為一種新興免疫治療方案，可特異性識別靶抗原、殺傷靶細(xì)胞，在治療難治性、復(fù)發(fā)惡性淋巴瘤中的完全緩解率高達(dá)90%[3]。但CAR-T治療后的細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokine release syndrome，CRS)發(fā)生率較高，患者臨床常表現(xiàn)為凝血功能異常、肝腎功能受損、發(fā)熱等，重度CRS可出現(xiàn)多器官功能障礙，甚至危及患者生命[4-5]。因此，早期預(yù)測、識別及干預(yù)IP、CRS等不良反應(yīng)是NHL患者免疫治療、化學(xué)治療成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。炎性體信號通路的異常激活在諸多炎性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中NOD樣受體家族3(NLRP3)炎性小體激活后可加快IL-18等炎性因子的分泌及成熟，加劇炎性反應(yīng)及組織損傷，故積極探討相關(guān)炎性體信號通路的激活機(jī)制及表達(dá)可指導(dǎo)臨床診治[6-7]。目前關(guān)于NLRP3炎性體信號通路的激活機(jī)制研究較少，且少見有關(guān)其在CRS、IP中的研究報道。鑒于此，本研究就NLRP3炎性小體水平檢測在NHL患者免疫治療相關(guān)CRS及化療相關(guān)IP中的預(yù)測價值進(jìn)行分析，旨在為CRS、IP的防治提供一個潛在的靶點(diǎn)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019年3月—2021年4月在北京協(xié)和醫(yī)院血液內(nèi)科接受CAR-T免疫治療聯(lián)合化療的NHL患者125例臨床資料，其中男68例，女57例；年齡39～79(53.65±6.27)歲；病程8～24(15.32±2.15)個月；淋巴瘤國際預(yù)后指數(shù)(IPI)評分(2.68±0.24)分；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(21.03±1.68)kg/m2；疾病類型：彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤101例，NK/T細(xì)胞淋巴瘤7例，濾泡淋巴瘤14例，淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤3例。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：符合NHL相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8-9]；化療前胸部CT顯示無IP及嚴(yán)重感染表現(xiàn)；臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：胸部CT顯示有間質(zhì)性改變，但未伴有任何臨床表現(xiàn)；化療期間新發(fā)真菌性、細(xì)菌性、病毒性肺部感染；難以耐受CAR-T免疫治療聯(lián)合化療；伴有心、肝、腎等重要臟器功能障礙或器質(zhì)性病變；伴有意識障礙、精神障礙、活動困難；妊娠期或哺乳期女性。

1.3 分組方法 (1) CRS ：生命體征平穩(wěn)，發(fā)熱和/或1級臟器毒性，無低血壓發(fā)生為1級CRS；2級臟器毒性，血壓降低和缺氧，使用低劑量升壓藥或靜脈補(bǔ)液可糾正低血壓，吸氧濃度<40%為2級CRS；3級臟器毒性，血壓降低和缺氧，使用大劑量升壓藥可糾正低血壓，吸氧濃度≥40%為3級CRS；4級臟器毒性，需呼吸機(jī)輔助呼吸，生命體征難以維持為4級CRS[10-11]。將發(fā)生1～4級CRS的患者99例納入CRS組，其余26例為非CRS組。(2)IP[12]：①臨床表現(xiàn)為咳嗽、氣促、咯痰、發(fā)熱、胸悶等；②胸部CT表現(xiàn)兩肺伴有斑片狀、蜂窩狀、網(wǎng)格狀、磨玻璃影，可伴或不伴有肺氣腫、胸膜增厚征、牽拉性支氣管擴(kuò)張、肺大泡。結(jié)合胸部CT確診IP 28例為IP組，未確診IP 97例為非IP組。

1.4 治療方法

1.4.1 CAR-T免疫治療：輸入前采用FC方案對腫瘤負(fù)荷進(jìn)行預(yù)處理，CAR-T細(xì)胞均為患者來源，回輸前第14 d，采集患者外周血淋巴細(xì)胞，送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行基因修飾，CAR-T細(xì)胞由北京億鳴復(fù)興生物科技有限公司制備，細(xì)胞結(jié)構(gòu)包括4-1BB/CD3ζ信號區(qū)、抗CD19 scFv、跨膜區(qū)；使用轉(zhuǎn)錄的病毒為慢病毒；回輸前1 d休息；分3次進(jìn)行CAR-T細(xì)胞回輸治療(第0、1、2 d分別回輸總劑量的10%、30%、60%)，CAR-T細(xì)胞回輸總數(shù)為0.62(0.39～1.30)×106個/kg；回輸當(dāng)日，使用鹽酸異丙嗪、吲哚美辛栓藥物，以預(yù)防過敏反應(yīng)。

1.4.2 化療方案：第1 d，環(huán)磷酰胺750 mg/m2，多柔比星40～50 mg/m2，長春地辛3～4 mg；第1～5 d，地塞米松15 mg。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 NLRP3炎性小體檢測：治療前采集患者外周血3 ml，置于EDTA抗凝試管，置于離心機(jī)中1 500 rpm×10 min，取血漿置于1.5 ml無菌EP管。參考Trizol試劑盒、總RNA提取試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)說明書提取血漿中總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按說明書進(jìn)行操作。以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用熒光定量PCR技術(shù)(PRISM 7000型定量PCR儀)檢測NLRP3炎性小體表達(dá)水平，總反應(yīng)體系為20 μl，將β-actin作為內(nèi)參，上游:5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3'，下游:5'-GCCCCATCTAACCCATGCTTC-3'。NLRP3上游:5'-GAGTTCTTCGCTGCTATGT-3'，下游:5'-ACCTTCACGTCTCGGTTC-3'。凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)上游：5'-CAACTGCGAGAAGGCTAT-3'，下游:5'-GTGACCCTGGCAATGAGT-3'。半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)上游:5'-TGGAAGGTAGGCAAGACT-3'，下游:5'-ATAGTGGGCATCTGGGTC-3'。PCR條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，共39個循環(huán)，72℃ 5min，收集熒光信號，用2-ΔΔCt法計算外周血NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達(dá)。

1.5.2 炎性因子檢測：治療后采集患者外周血3 ml，置于離心機(jī)中3 000 rpm×5 min，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清白介素(IL)-6、IL-10、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，試劑盒購自科邦興業(yè)(北京)科技有限公司；采用免疫比濁法測定C反應(yīng)蛋白(CRP)水平，試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.5.3 血常規(guī)及生化指標(biāo)檢測：采集患者治療后外周血，采用COULTER LH 780/LH 785血細(xì)胞分析儀[貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司]測定中性粒細(xì)胞計數(shù)(N)、血小板計數(shù)(PLT)、單核細(xì)胞計數(shù)(MON)、淋巴細(xì)胞計數(shù)(L)水平；采用ELISA法測定白蛋白(Alb)水平，采用速率法(上海梵態(tài)生物科技有限公司)測定α-羥丁酸脫氫酶(α-HBDH)、乳酸脫氫酶(LDH)水平。

2 結(jié) 果

2.1 CRS組、非CRS組一般資料比較 CRS組性別、年齡、病程、IPI評分、BMI、疾病類型與非CRS組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 CRS組、非CRS組一般資料比較

2.2 CRS組、非CRS組NLRP3炎性小體各基因mRNA表達(dá)比較 CRS組外周血NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達(dá)水平均高于非CRS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 CRS組、非CRS組NLRP3炎性小體各基因mRNA表達(dá)比較

2.3 CRS組、非CRS組炎性細(xì)胞因子表達(dá)比較 CRS組外周血CRP、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平均高于非CRS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 CRS組、非CRS組炎性細(xì)胞因子表達(dá)比較

2.4 CRS組、非CRS組血常規(guī)及血生化指標(biāo)比較 CRS組PLT、N、MON、L、α-HBDH、Alb水平與非CRS組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CRS組LDH水平高于非CRS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表4 CRS組、非CRS組血常規(guī)及血生化指標(biāo)比較

2.5 NLRP3炎性小體表達(dá)與炎性細(xì)胞因子、血生化指標(biāo)水平相關(guān)性 雙變量Preason相關(guān)性顯示，CRS患者外周血NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達(dá)均與CRP、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α、LDH水平呈正相關(guān)(P<0.01)，見表5。

表5 NLRP3炎性小體表達(dá)與炎性細(xì)胞因子、血生化指標(biāo)水平相關(guān)性

2.6 IP組、非IP組一般資料比較 IP組性別、年齡、病程、IPI評分、BMI及疾病類型與非IP組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表6。

表6 IP組、非IP組一般資料比較

2.7 IP組、非IP組NLRP3炎性小體各基因mRNA表達(dá)比較 IP組外周血NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達(dá)水平均高于非IP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表7。

表7 IP組、非IP組NLRP3炎性小體各基因mRNA表達(dá)比較

2.8 IP組、非IP組血常規(guī)及血生化指標(biāo)比較 IP組血常規(guī)、血生化相關(guān)指標(biāo)水平與非IP組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表8。

表8 IP組、非IP組血常規(guī)及血生化指標(biāo)比較

2.9 IP組、非IP組炎性細(xì)胞因子表達(dá)比較 IP組外周血CRP、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平均高于非IP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表9。

表9 IP組、非IP組炎性細(xì)胞因子表達(dá)比較

2.10 NHL患者CRS、IP發(fā)生的危險因素分析 將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)納入自變量，將NHL患者是否發(fā)生CRS、IP作為因變量，經(jīng)Logistic回歸分析顯示，NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達(dá)升高均為影響NHL患者CRS、IP發(fā)生的危險因素(P<0.05)，見表10、11。

表10 影響NHL患者CRS發(fā)生的多因素分析

2.11 NLRP3炎性小體表達(dá)預(yù)測NHL患者CRS、IP發(fā)生的價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，NLRP3、ASC、Caspase-1及三者聯(lián)合預(yù)測NHL患者CRS發(fā)生的AUC分別為0.890、0.715、0.800、0.916，預(yù)測IP發(fā)生的AUC分別為0.901、0.868、0.880、0.935，見表12、圖1、圖2。

圖1 NLRP3炎性小體預(yù)測CRS的ROC圖

圖2 NLRP3炎性小體預(yù)測IP的ROC圖

表11 影響NHL患者IP發(fā)生的多因素分析

表12 NLRP3炎性小體基因表達(dá)預(yù)測NHL患者CRS、IP發(fā)生的價值分析

3 討 論

正常狀態(tài)下，機(jī)體抗炎性細(xì)胞因子與促炎性細(xì)胞因子保持相對平衡，當(dāng)病毒、細(xì)菌等侵入機(jī)體后可導(dǎo)致諸多免疫細(xì)胞激活，釋放大量細(xì)胞因子，當(dāng)體內(nèi)細(xì)胞因子到達(dá)某一閾值即可引起CRS。而IP的發(fā)生也與炎性因子密切相關(guān)，故從該角度而言2種疾病的發(fā)生機(jī)制存在一定共性?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，炎性小體與動脈粥樣硬化、慢性關(guān)節(jié)炎等炎性疾病及腫瘤密切相關(guān)[13]。NLRP3炎性小體是目前研究熱點(diǎn)，其常表達(dá)于單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中，是由Caspase-1、ASC及NLRP3組成的蛋白復(fù)合物，其可通過調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫及固有免疫、腸道微生物、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)行為影響腫瘤進(jìn)程，其活化介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可影響腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等階段[14-15]。關(guān)于NLRP3炎性小體與CRS、IP關(guān)系的研究是近年來國內(nèi)外新的方向及思路，相關(guān)報道少見。

CAR-T免疫療法是一種精準(zhǔn)型靶向治療腫瘤細(xì)胞技術(shù)，通過提取患者自身T淋巴細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后回輸至患者體內(nèi)，以達(dá)到攻擊自身腫瘤細(xì)胞的目的。Neelapu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，101例彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤經(jīng)CAR-T細(xì)胞免疫治療后的完全緩解率、總體反應(yīng)率分別為54%、82%，18個月總生存率為52%。肖霞等[17]研究報道，22例B細(xì)胞淋巴瘤輸注CAR-T細(xì)胞后總體完全緩解率、部分緩解率、總有效率分別為45.5%、31.8%、77.3%，但CRS的發(fā)生率為63.6%。目前，臨床針對CRS的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，多認(rèn)為與免疫細(xì)胞過度激活、細(xì)胞因子大量釋放等有關(guān)。Hu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，CAR-T細(xì)胞的單鏈抗體可變區(qū)片段與腫瘤細(xì)胞表面的靶抗原相結(jié)合后，可促使IL-10、IFN-γ、IL-6等炎性細(xì)胞因子大量分泌，導(dǎo)致抗炎、促炎細(xì)胞因子失衡，進(jìn)而造成劇烈的炎性免疫反應(yīng)發(fā)生。Shimabukuro-Vornhagen等[19]研究報道，CAR-T治療后CRS的發(fā)生與靶細(xì)胞直接裂解所釋放的IFN-γ、IL-6等因子有關(guān)，且還可能由活化的T細(xì)胞釋放的趨化因子及促炎細(xì)胞因子刺激內(nèi)皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活化所誘導(dǎo)。本研究中，CRS組外周血NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達(dá)及CRP、IL-6、IL-10等炎性細(xì)胞因子水平均高于非CRS組，NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達(dá)水平均與炎性細(xì)胞因子水平呈正相關(guān)，且三者升高是CRS發(fā)生的危險因素，聯(lián)合預(yù)測CRS發(fā)生的AUC為0.916，可見NLRP3炎性小體的活化在CRS患者CRP、IL-6等各種炎性因子的釋放及成熟過程中發(fā)揮重要作用，且可有效預(yù)測CRS的發(fā)生。推測其原因可能在于NLRP3通路信號被激活后可經(jīng) Caspase-1水解前體IL-18、前體IL-1β等，使其成為具有活性的IL-18、IL-1β，進(jìn)一步誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子的加工分泌、細(xì)胞凋亡，從而調(diào)節(jié)固有免疫系統(tǒng)過程，加劇炎性反應(yīng)。

國內(nèi)外關(guān)于NHL患者化療后IP發(fā)生率的報道不一，蒙延娜等[20]研究報道，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤接受RCHOP、RCDOP化療方案后的IP發(fā)生率分別為2.60%、28.95%。Huang等[21]研究報道，NHL患者化療后IP發(fā)生率為4.9%。臨床針對化療相關(guān)IP的診斷以影像學(xué)特點(diǎn)、臨床表現(xiàn)為主，但仍面臨一定挑戰(zhàn)，如影像學(xué)特征中的磨玻璃樣表現(xiàn)與肺孢子蟲感染或病毒性感染相似，臨床癥狀與感染性肺部疾病難以鑒別。近年來，不斷有研究證實(shí)，NLRP3炎性小體與肺部疾病相關(guān)。張燕等[22]研究報道，NLRP3 mRNA可能參與活動期結(jié)核的炎性反應(yīng)過程。張帆等[23]研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體促分泌產(chǎn)物IL-18、IL-1β可有效預(yù)測風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎合并IP。本研究中，IP組外周血NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達(dá)水平均高于非IP組，且NLRP3炎性小體預(yù)測化療相關(guān)IP發(fā)生的AUC為0.935，可見NLRP3炎性小體表達(dá)在IP的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，推測其機(jī)制可能與炎性小體的激活物和/或炎性小體的效應(yīng)產(chǎn)物均存在于IP患者的氣道中，可伴隨炎性因子活性增加并與炎性小體的信號通路激活有關(guān)；此外，NLRP3炎性小體可通過活化后產(chǎn)生的IL-1β等炎性因子調(diào)控TGF-β表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞，合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)基質(zhì)沉積，從而導(dǎo)致肺纖維化，誘發(fā)IP。但本研究為單中心、回顧性分析，且納入的樣本量較少，導(dǎo)致結(jié)果存在一定偏倚，故后期需進(jìn)一步展開前瞻性、大樣本量的臨床研究。

綜上所述，NHL初診時NLRP3炎性體信號通路的異?；罨c炎性細(xì)胞因子水平相關(guān)，且NLRP3炎性小體表達(dá)水平是影響CRS及IP發(fā)生的危險因素，可有效預(yù)測CRS及IP發(fā)生。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張艷彬：提出研究思路，設(shè)計研究方向，課題設(shè)計，論文撰寫；陳文昆：設(shè)計研究方案、研究流程；周寅：實(shí)施研究過程，資料搜集整理；張小娟：分析整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；李魁星：課題設(shè)計，論文審核，論文修改