楊天宇 馬曉宇 貢笑笑 彭 程 黃 杰 趙國琦,2,3 詹 康*

(1.揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.揚州大學 農業(yè)科技發(fā)展研究院，江蘇 揚州 225009；3.揚州大學 教育部農業(yè)與農產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 揚州 225009)

犢牛時期是奶牛飼養(yǎng)過程中重要環(huán)節(jié)，犢牛生長性能受飼料成分和飼喂方式等多種因素的影響[1]。提供合理的日糧不僅可以提高飼糧的利用率，還可提高其成年后的總體發(fā)育水平。因此，犢牛培育是提高牛群品質和創(chuàng)建高產(chǎn)奶牛群的關鍵。以前奶牛營養(yǎng)研究關注點主要在泌乳奶牛，而近些年來，更多的研究集中在幼齡反芻動物營養(yǎng)方面[2]。

葡萄糖作為體內重要的營養(yǎng)單糖，是動物體內唯一可以通過血漿和細胞循環(huán)于全身的碳水化合物，參與多種細胞功能[3]。在反芻動物中，循環(huán)葡萄糖的90%～100%均來自糖異生。此外，調節(jié)反芻動物糖異生是改善動物健康、生長與生產(chǎn)性能的有效手段[3]。糖異生在犢牛生長發(fā)育發(fā)揮著至關重要的作用[4]。犢牛出生后經(jīng)歷的一個關鍵適應過程是：從子宮中葡萄糖、乳酸、氨基酸和脂肪酸獲取能量，轉變?yōu)橐蕾囉谌樘恰⒌鞍踪|和脂肪通過消化轉變?yōu)槠咸烟?、氨基酸和脂肪酸獲取能量[5-6]。Elwyn等[7]研究表明，在消化蛋白的過程中，肝臟通過門靜脈吸收多余氨基酸為糖異生儲備糖原。與單胃動物不同，反芻動物從腸道中吸收的葡萄糖很少，都不同程度地依賴氨基酸作為糖異生底物產(chǎn)生葡萄糖。處于生長階段的反芻動物需要大量的氨基酸通過糖異生途徑合成葡萄糖[8]。此外，參與糖異生途徑的關鍵限速酶包括磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK)、丙酮酸羧化酶(PC)、果糖-1,6-二磷酸酶1(FBP1)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)。提高肝糖異生與PCK和PC的表達增加有關[9-10]。此外，PC負責將線粒體中的丙酮酸轉化為草酰乙酸，其啟動子是通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC1A)的活化而被轉錄激活[11]；PGC1A可以調節(jié)關鍵的線粒體基因，這些基因有助于促進糖異生途徑[12]。而FBP1酶催化果糖1,6-二磷酸轉化為果糖6-磷酸。Wang等[13]研究表明，F(xiàn)BP1酶活性的降低會導致葡萄糖產(chǎn)量的下降。葡萄糖異生的最后一步，即G6PC酶催化葡萄糖6-磷酸，是葡萄糖從肝細胞釋放的必要步驟[14]。

日糧中蛋白質是犢牛獲取氨基酸最重要的途徑。蛋白質是影響犢牛生長性能的重要因素。飼糧中蛋白質水平對反芻動物的生長性能、氮代謝、瘤胃發(fā)育有著促進作用[15]。前人研究表明日糧中蛋白水平在18%～21%可提高反芻動物的生長性能、采食量和蛋白利用率[16-17]。液體和固體是犢牛飼料兩種形態(tài)。顆粒料既提供了均衡的營養(yǎng)成分，又可以直接進入瘤胃，促進瘤胃的發(fā)育[18]，同時也為成年時期提供了良好營養(yǎng)物質代謝的前提[19]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)21.02%的蛋白水平更有利于5月齡公犢牛的生長發(fā)育[20]。

之前的研究均集中在不同蛋白水平對荷斯坦公犢牛生長性能的影響，而不同蛋白水平全價顆粒料能否對荷斯坦公犢牛糖異生途徑產(chǎn)生影響？因此，本研究旨在探究不同蛋白水平全價顆粒日料對5～6月齡荷斯坦公犢牛糖異生影響，以為進一步探究高蛋白水平全價顆粒料對犢牛糖異生途徑的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2017年4月—2017年6月在揚州大學農牧場進行，選擇月平均月齡為5月齡，體重(172.80±7.16) kg 10頭荷斯坦公犢牛(隨機分為2組，每組5頭。試驗每組分別添加蛋白含量為15.05% 和21.02%的犢牛全價顆粒料，15.05%的犢牛全價顆粒料記為LP及21.02%的犢牛全價顆粒料記為HP組，自由飲水。按試驗牛體重的3%進行飼喂。通過每周更改一次顆粒料的飼喂量，確保LP與HP組犢牛的干物質飼喂量基本一致。試驗分為預試期和正試期，預試期7 d，正試期56 d。飼養(yǎng)試驗結束后，將所有供試牛，在禁食(自由飲水)24 h后進行屠宰，收集3 g肝臟到2 mL離心管，迅速放入液氮中，回到實驗室于-80 ℃冰箱凍存。

試驗期間，日糧采用全價顆粒料，自由采食，營養(yǎng)需要參照NRC(2001)。全價顆粒營養(yǎng)成分見表1。

表1 全價顆粒料組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient level of whole grain (DM basis)

1.2 樣本采集

在正試期第56 天，于晨飼5 h后，在犢牛頸部頸靜脈使用真空采血管進行采血，采血量約為20 mL，在真空采血管中(無抗凝劑)轉入5 mL血樣，靜置30 min，3 500 r/min 15 min離心，制備的血清樣品于-80 ℃冰箱中保存。

試驗結束后，共10頭試驗公犢牛，在禁食(自由飲水)24 h后進行屠宰，收集3 g肝臟，迅速放入液氮中，回到實驗室放入-80 ℃冰箱凍存。

1.3 肝臟和血清中葡萄糖的測定

精確稱取50 mg肝臟組織放入離心管后，加入250 μL裂解液，用電動勻漿器勻漿破碎組織，勻漿后室溫靜置10 min。取230 μL上清液轉移至1.5 mL 離心管中，取剩下的裂解液用BCA法進行蛋白質量濃度測定。

制備好的血清樣品和肝臟裂解液，采用葡萄糖試劑盒(購于北京普利萊基因技術有限公司)測定葡萄糖(GLU)。

1.4 肝臟中氨基酸測定

稱取肉樣70 mg，加500 μL 6 mol/L HCL，勻漿60 s。將其轉移至20 mL安瓿瓶，2 mL 6 mol/L HCL清洗勻漿器，然后使用6 mol/L HCL定容至10 mL。放-20 ℃冰箱5 min，氮吹儀去掉空氣，酒精噴燈封口。在110 ℃下水解24 h，1 h后搖動一次；24 h后拿出冷卻至室溫，全部轉移至50 mL容量瓶，使用超純水定容后搖勻。用0.22 mm水相濾膜過濾1 mL取500 μL至1.5 ml離心管中，氮吹儀吹干。200 μL 0.1 mol/L HCL 溶解，漩渦震蕩。加20 μL 正亮AA,加100 μL三乙氨已膘溶液，加100 μL 衍生試劑c異硫睛酸苯芷，混勻，室溫靜置1 h。加正己烷400 μL，漩渦震蕩，室溫15 min。取下層液體，0.22 mm濾膜過濾后，取200 μL濾液+800 μL超純水。最后取10 μL上樣。譜柱：SunFireTM C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)裝有SunFireTM C18保護住(4.6 mm×20 mm, 5 μm)；流動相A：0.1 mol/L醋酸鈉乙腈溶液(93∶7)，pH 6.5；流動相B：乙腈-甲醇-超純水溶液，比例為80∶10∶10；梯度洗脫，程序見表1，流速0.7 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長254 nm。測定肝臟中17種氨基酸。

1.5 肝臟總RNA提取和反轉錄成cDNA

稱50 mg肝臟組織于1.5 mL離心管，按照總RNA提取試劑盒(Tiangen，中國)提取總RNA。最后，取1 μL提取的樣品進行總RNA濃度和純度的測定。按照Takara反轉錄試劑盒進行。反轉錄體系為10 μL，反應條件：37 ℃ 15 min和85 ℃ 5 s；PCR反應體系為20 μL，反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，每個樣品都有3個重復。

1.6 Real-time PCR

熒光定量PCR反應配置總體系為20.0 μL，其中SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ Kit 10.0 μL；10 μmol/L 的PCR Forward primer和PCR Reverse Primer各0.8 μL；Water PCR grade 6.4 μL；cDNA 2.0 μL。引物詳情見表2。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，每個樣品都有3個重復。計算方法按照2-ΔΔCt。因為在奶牛中甘油醛3磷酸脫氫酶(GAPDH)基因穩(wěn)定性高。因此，以GAPDH作為內參基因對糖異生關鍵的mRNA表達進行歸一化處理。

表2 熒光定量PCR引物信息Table 2 Information of reverse-transcription PCR primers

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

結果采用“平均數(shù)±標準誤”表示。運用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件中的獨立樣本t檢驗進行顯著性檢驗。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白水平的日糧對犢牛血清和肝臟葡萄糖含量的影響

不同蛋白水平的日糧對犢牛血清和肝臟葡萄糖的含量，結果見表3。與低蛋白組相比，高蛋白組極顯著提高(P<0.01)肝臟中的葡萄糖含量，同時也顯著提高(P<0.05)血清中葡萄糖含量。

表3 不同蛋白水平飼料對犢牛血清和肝臟葡萄糖含量的影響Table 3 Effects of protein at different concentrations on glucose content in serum and liver of Holstein bull calves

2.2 不同蛋白水平的日糧對犢牛肝臟氨基酸含量的影響

采用液相色譜的方法檢測犢牛肝臟中氨基酸的含量見表4。與低蛋白組相比，高蛋白組顯著提高(P<0.05)Asp、Ala、Ser、Leu、Lys、Phe、Ile、Val、Tyr、Arg、Glu和His的含量，極顯著提高(P<0.01)Gly和Pro的含量，但未改變Thr和Met的含量。

表4 不同蛋白水平飼料對犢牛肝臟氨基酸含量的影響Table 4 Effects of protein at different concentrations on amino acidscontent in liver of Holstein bull calves mg/g

2.3 不同蛋白水平的日糧對犢牛肝臟糖異生關鍵基因表達水平的影響

采用qRT-PCR分別檢測PCK1、PCK2、PC、FBP1、G6PC和PGC1A在不同蛋白水平日料飼喂犢牛的肝臟中的表達變化(表5)。與高蛋白組相比，高蛋白組顯著提高了(P<0.05)PCK2、PC和PGC1A基因表達量，極顯著提高了(P<0.01)PCK1基因表達量，其他基因無顯著差異。

表5 不同蛋白水平飼料對犢牛肝臟糖異生途徑關鍵基因mRNA表達的影響Table 5 Effects of protein at different concentrations on mRNA expression of key genes of gluconeogenesis pathway in liver of male calves

3 討論與結論

糖異生對犢牛生長發(fā)育起著重要的作用[4]。尤其在進食后，當代謝產(chǎn)物大量流入血液時，糖異生起著至關重要的角色[22]。通過氨基酸轉成為葡萄糖是糖異生經(jīng)典途徑之一[23]。除了賴氨酸和亮氨酸外，其他的氨基酸都可以通過糖異生途徑生成糖。在維持飼養(yǎng)水平的反芻動物中，內源性葡萄糖最少有15%是由氨基酸轉化而來的，來自肝臟攝取的氨基酸占32%。在生長階段的反芻動物，需要大量的氨基酸去合成葡萄糖維持生長發(fā)育[24]。而日糧中蛋白質是氨基酸的最重要來源。以往的研究主要集中在不同水平蛋白日糧對犢牛生長性能、血清生化和瘤胃發(fā)酵的影響，但不同水平蛋白日糧對犢牛糖異生的影響尚不清楚。因此本研究旨在不同蛋白水平全價顆粒日糧對犢牛糖異生的影響。

在正常飼養(yǎng)水平下，反芻動物血糖濃度總是維持在一定的恒定范圍之內，這對維持機體各組織細胞的能耗和功能發(fā)揮著重要作用。外源葡萄糖的吸收和內源性糖異生作用都對血糖濃度有影響，而內源性糖異生作用主要來自肝糖異生[25]。本課題組前期研究表明[20]，高蛋白組會提高3 h血清中葡萄糖含量，但顯著不差異。李輝等[26]研究表明，22%蛋白水平也可提高犢牛血糖含量。低蛋白組由于采食的日糧水平較低，犢牛對營養(yǎng)物質的消化吸收能力較差，難以提供足夠的葡萄糖。本研究表明，日糧中高水平蛋白(21.02%)可以顯著提高犢牛5 h血清葡萄糖和屠宰后肝臟葡萄糖含量。這可能是蛋白質消化為氨基酸在肝臟通過糖異生作用促進血糖提高的原因。但是關于犢牛的氨基酸肝臟糖異生研究很少有報道。肝臟是氨基酸主要代謝的場所。除了賴氨酸和亮氨酸外的18種常見氨基酸均可以通過糖異生途徑生成葡萄糖。本研究中發(fā)現(xiàn)，除了蘇氨酸和蛋氨酸以外，21.02%蛋白水平組增加了肝臟中其他氨基酸的含量。

糖異生途徑包含4種關鍵的限速酶，即PC、PCK、FBP1和G6PC。草酰乙酸是由PC編碼的酶催化線粒體中丙酮酸得來的，提供糖異生中間體補充所需的草酰乙酸。在糖異生作用的增加時候，PC的mRNA表達被促進以響應來自糖原性AA和乳酸的草酰乙酸[9]。本研究表明，與低蛋白組組相比，高蛋白組組可以顯著提高PC的mRNA表達量。蘋果酸是草酰乙酸在線粒體蘋果酸脫氫酶的還原作用下生成的，并輸出到細胞質中，并在細胞質中蘋果酸脫氫酶氧化作用后再次生成草酰乙酸。PCK1和PCK2酶分別催化草酰乙酸在細胞質和線粒體中形成磷酸烯醇式丙酮酸。在細胞中，磷酸烯醇式丙酮酸是由PCK1催化草酰乙酸產(chǎn)生，這是糖異生的關鍵反應。本研究發(fā)現(xiàn)，高蛋白組可顯著促進PCK1的mRNA表達量。先前的研究報道表明，氨基酸進入糖異生是由PC和PCK1編碼的酶調節(jié)的，而不是PCK2，因為氨基酸形成磷酸烯醇式丙酮酸需要在胞漿中獨立合成NADH[27]。PC和PCK1的 mRNA表達量的增加，進一步暗示了飼喂高蛋白可促進肝臟中磷酸烯醇式丙酮酸濃度增加，進而滿足下一步糖異生反應。盡管以氨基酸作為前體物質的糖異生并不依賴PCK2，但是PCK2也在糖異生發(fā)揮著重要的作用。在單胃動物的肝臟中，PCK2只占總磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的大約1%～5%[28]，但在反芻動物中PCK1和PCK2的活性大致相等[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，高蛋白組可顯著促進PCK2的mRNA表達量。FBP1和G6PC的功能是催化果糖1,6-二磷酸轉變?yōu)槠咸烟?。盡管本研究顯示，高蛋白組并未有顯著的提高FBP1和G6PC的mRNA的表達量。先前的研究表明，高蛋白飲食增加了肝臟中PCK的活性，但對G6PC的活性影響不大[29-30]。PGC1A作為一種調節(jié)與能量代謝相關基因的轉錄輔激活物[31]。此外，PGC1A還參與糖異生關鍵基因的表達，通過提高PCK啟動子的轉錄活性去提高肝臟中的PCK的表達水平。與低蛋白組相比，高蛋白組顯著提高了PGC1A的mRNA表達量。此外，Dai等[32]研究發(fā)現(xiàn)高水平的氨基酸可以提高肝臟糖異生基因的表達和氨基酸的利用效率。本研究表明，日糧中高蛋白水平可以提高肝臟中氨基酸豐度同時增加肝臟糖異生關鍵基因的表達量，進而促進糖異生生成葡萄糖提供機體所需的能量。