尚方正 馬 榮 戎友俊 王 敏 潘劍鋒 梁麗麗 張燕軍* 李金泉

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部肉羊遺傳育種重點實驗室 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，呼和浩特 010018；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)山羊遺傳育種工程技術研究中心，呼和浩特 010018)

circRNA是一類比較特殊的RNA，它沒有游離的5′帽子結(jié)構(gòu)和3′poly(A)結(jié)構(gòu)，并且對核酸酶不敏感[1]。circRNA的作用機制主要包括：調(diào)控親本基因的表達[2-3],與 RNA 結(jié)合蛋白相互作用[4],翻譯蛋白質(zhì)[5],作為競爭性內(nèi)源RNA調(diào)控基因的表達[6-8]。絨山羊毛囊發(fā)育受多種信號分子的調(diào)控，特別是近年來較多的circRNA在絨山羊毛囊發(fā)生發(fā)育有了部分研究進展。研究發(fā)現(xiàn)circRNA-1926 可與miR-148a/b-3p 競爭性結(jié)合，促進CDK19基因的表達和絨山羊次級毛囊干細胞的分化[9-10]；通過對成年的遼寧絨山羊和內(nèi)蒙古絨山羊生長期皮膚樣本轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析，在遼寧絨山羊中鑒定出17個上調(diào)的circRNAs和15個下調(diào)的circRNAs，進一步研究發(fā)現(xiàn)ciRNA128、circRNA6854、circRNA4154和circRNA3620在不同毛被遼寧絨山羊中存在顯著差異表達，揭示circRNA可能對羊絨細度有調(diào)控作用[11]。其他方面研究發(fā)現(xiàn)在湖羊皮膚毛囊中共鑒定出5 527個circRNA，其中在卷毛和直毛比對組中有114個差異表達的circRNA。circRNA在絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育中的研究還相對匱乏。

絨山羊毛囊可分為初級毛囊和次級毛囊。初級毛囊與次級毛囊形態(tài)發(fā)生的啟動處于胎兒發(fā)育的不同時期，張燕軍等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)初級毛囊的啟動早于次級毛囊。在胎兒期45～55 d，皮膚形成完整的表皮結(jié)構(gòu)，毛囊還未發(fā)生；在55～65 d，胎兒各部位初級毛囊開始發(fā)生；在65 d時，體側(cè)部可觀察到明顯的初級毛囊毛芽；在65～75 d，在胎兒各部位可觀察到次級毛囊原始體，次級毛囊開始發(fā)生；在75 d時，體側(cè)部可觀察到明顯的次級毛囊毛芽。

研究發(fā)現(xiàn)，定位于細胞質(zhì)中的外顯子circRNA主要和mRNA競爭miRNA的靶標結(jié)合位點，從而調(diào)控mRNA的表達[14]；而內(nèi)含子circRNA主要通過參與其親本基因的表達，如circ-ankrd52是來自于ANKRD52的第二內(nèi)含子，ci-ankrd52的敲低會導致ANKRD52 mRNA的表達顯著降低，表明ci-ankrd52 參與了其親本基因的的順式表達[15]。因此，本研究在課題組前期得到絨山羊胎兒期(45、55、65和75 d)4個時期皮膚組織circRNA表達譜的基礎上[16]，篩選鑒定絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育相關的外顯子circRNA和內(nèi)含子circRNA，并初步探究其功能，為后續(xù)解析circRNA在絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育中的分子機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于內(nèi)蒙古金萊牧業(yè)科技有限責任公司選取12只飼喂條件相同的內(nèi)蒙古絨山羊阿爾巴斯型三歲母羊分為四組，每組3只，進行同期發(fā)情處理，記錄配種時間。采取胎兒期45、55、65和75 d各3只羊皮膚樣品。剖腹產(chǎn)后用焦碳酸二乙酯水清洗胎兒。使用無菌、無酶的一次性手術刀和鑷子快速采集體側(cè)部皮膚，放入冷凍儲存管中，編號，在液氮中快速冷凍，并儲存在-80 ℃冰箱中，用于qRT-PCR 試驗。所有的胎兒皮膚標本均按照國際動物研究指導原則采集，并獲得內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學科學研究和學術道德委員會和內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生物醫(yī)學研究倫理的批準(批準文號[2020]056)。

1.2 絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育相關circRNA的篩選

基于全轉(zhuǎn)錄組測序得到的circRNA在絨山羊胎兒期(45、55、65和75 d)4個時期表達譜RNA-Seq數(shù)據(jù)被提交到SRA數(shù)據(jù)庫，注冊號(SRR13306949、SRR13306948、SRR13306947、SRR13306946、SRR13306945、SRR13306944、SRR13306943、SRR13306942、SRR13306941、SRR13306940、SRR13306939、SRR13306938)及各比對組中差異表達的circRNA(log2(Fold Change)絕對值≥1且P<0.05)。因此結(jié)合毛囊在不同時期的發(fā)生發(fā)育研究結(jié)果，篩選絨山羊毛囊發(fā)生發(fā)育關鍵circRNA。

1.3 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄DNA制備

總RNA的提取按照Trizol Reagent試劑操作說明進行。將提取的總RNA用NanoDrop 2000紫外分光光度計測定總RNA的質(zhì)量濃度。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。將總RNA等量分成兩份，一份不做處理(供內(nèi)參定量使用)，另一份經(jīng)RNase R(RNA外切酶)37 ℃ 25 min，70 ℃ 10 min處理去除線性RNA。按照Takara的 PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒置于PCR儀中37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃∞獲得 cDNA模板。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA放置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設計

以circRNA的全長序列為模板設計絨山羊毛囊發(fā)育相關circRNA的引物，β-actin作為內(nèi)參基因，相關引物信息詳見表1，引物由廣州銳博生物有限公司合成。

表1 circRNA qRT-PCR引物序列信息Table 1 circRNA qRT-PCR primer sequence information

1.5 circRNA 的實時熒光定量PCR驗證

qRT-PCR反應體系為20 μL，其中TB Green premix EXTapⅡ10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O 6 μL。使用LightCycler?96 PCR擴增儀進行擴增，擴增程序為：預變性：95 ℃ 30 s；PCP反應：95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；熔解：95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s；冷卻：37 ℃ 30 s。利用2-ΔΔCt進行計算。

1.6 外顯子circRNA調(diào)控網(wǎng)絡的構(gòu)建

運用TargetScan和miRanda(分析TargetScan和miRanda值的大小，TargetScan閾值為50，該值越大說明兩者存在互作的可能性越大；miRanda閾值為-10，該值越小說明兩者存在互作的可能性越大)，初步得到circRNA-miRNA靶向關系，進一步對靶向miRNA的靶基因進行預測，將富集到毛囊發(fā)育相關重要通路WNT、TGF-β和Notch等信號通路中的靶基因構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡作為毛囊發(fā)生發(fā)育相關circRNA-miRNA-mRNA重要的調(diào)控網(wǎng)絡。并用Cytoscape將其可視化。

1.7 內(nèi)含子circRNA宿主基因的功能分析

綜合分析22個差異表達內(nèi)含子circRNA宿主基因在KEGG的富集情況，探究其富集的通路是否有與絨山羊胎兒期毛囊發(fā)育相關的通路。

1.8 生物信息學分析及相關數(shù)據(jù)分析

運用Hisat2和Tophat-fusion軟件進行參考基因組比對分析，運用CIRCExplorer和CIRI鑒定識別circRNA，得到circRNA其序列全長及來源基因，進一步在NCBI查找相應circRNA的結(jié)構(gòu)組成(Ensembl)。最后使用Cytoscape將circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡可視化。

運用SPSS 18.0進對相關數(shù)據(jù)進行Kruskal-Wallis秩和檢驗及Nemenyi檢驗，其中P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育相關circRNA的篩選

在絨山羊胎兒期45、55、65和75 d皮膚中分別鑒定出2 910、3 710、3 228和3 059個circRNA。其中在絨山羊胎兒D75組與D45組中上調(diào)59個，下調(diào)33個circRNA；胎兒D65組與D45組中上調(diào)96個，下調(diào)63個circRNA；胎兒D55組與D45組中，上調(diào)76個，下調(diào)42個circRNA。將上述3個比對組中均差異表達的circRNA作為毛囊發(fā)生發(fā)育相關的circRNA(圖1)。共篩選到4個絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育相關的circRNA，包括circRNA2049、circRNA2225、circRNA3411和circRNA5681。

圖1 絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育相關circRNA的篩選Fig.1 Screening of circRNAs related to hair follicle development in cashmere goats during fetal period

2.2 絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育相關circRNA的鑒定

circRNA2049長度為536 bp，由山羊ATRNL1基因第2～5外顯子的全部序列組成，為外顯子circRNA；circRNA2225長度為791 bp，由山羊SERINC5基因第3～8外顯子的全部序列組成，為外顯子circRNA；circRNA5681序列長度為265 bp，由山羊基因102 184 877第3～5外顯子的全部序列組成，為外顯子circRNA；circRNA3411長度為333 bp，由山羊102 173 234基因第175～178外顯子的全部序列組成，為外顯子circRNA(表2)。

表2 絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育相關circRNA的結(jié)構(gòu)組成Table 2 The structural composition of circRNA related to hair follicle development in the fetal period of cashmere goats

表2(續(xù))

2.3 絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育相關circRNA差異表達分析

本研究運用qRT-PCR檢測了circRNA2049、circRNA2225、circRNA3411和circRNA5681在絨山羊胎兒期(45、55、65和75 d)皮膚組織中的表達量。Kruskal-Wallis秩和檢驗表明上述circRNA在4個時期中均差異表達(P<0.05)，Nemenyi組間多重比較發(fā)現(xiàn)circRNA2049、circRNA2225和circRNA5681在D65vsD55差異顯著(P<0.05)(圖2)。表明circRNA2049、circRNA2225和circRNA5681可能調(diào)控初級毛囊的發(fā)生；circRNA3411在D75vsD45差異顯著(P<0.05)，推測circRNA3411可能調(diào)控次級毛囊的發(fā)生。

*P<0.05表示差異顯著。* P<0.05 indicates significant difference.圖2 絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育相關circRNA qRT-PCR驗證分析Fig.2 Validation analysis of circRNA qRT-PCR related to hair follicle development in the fetal period of cashmere goats

2.4 絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育相關circRNA靶向miRNA的預測

本研究運用TargetScan和miRanda預測了篩選到的4個外顯子circRNA靶向的miRNA(TargetScan score percentile>50且miRanda energy<-10)。其中circRNA2049有19個靶向的miRNA，circRNA2225有8個靶向miRNA，circRNA3411有4個靶向miRNA，circRNA5681有1個靶向miRNA(表3)。

表3 TargetScan和miRanda 預測circRNA靶向的miRNATable 3 Prediction of miRNAs targeted circRNA by Targetscan and miRanda

表3(續(xù))

2.5 絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育外顯子circRNA調(diào)控網(wǎng)路構(gòu)建

本研究基于上述circRNA靶向miRNA的預測結(jié)果，同樣利用TargetScan和miRanda預測靶向miRNA的靶基因。并結(jié)合mRNA的富集情況，篩選富集在Notch signaling pathway 和TGF-β signaling pathway與毛囊發(fā)生發(fā)育相關的重要信號通路中的mRNA構(gòu)建了調(diào)控絨山羊毛囊發(fā)生發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡。其中DLL4位于NOTCH信號通路的起始段，同時研究表明DLL4與羊毛囊發(fā)育相關。因此circRNA2049-chi-miR-27b-3p-DLL4，circRNA2225-chi-miR-145-5p-DLL4和circRNA9181-chi-miR-145-5p-DLL4成為后續(xù)絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育的重要調(diào)控網(wǎng)絡(圖3)。

綠色三角形為circRNA;粉色四邊形為miRNA;藍色圓形為mRNA。The green triangle was circRNA; The pink quadrilateral was miRNA; Blue circle was mRNA.圖3 絨山羊毛囊發(fā)生發(fā)育重要circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡Fig.3 The important circRNA-miRNA-mRNA regulatory network of hair follicle development in cashmere goats

2.6 絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育相關內(nèi)含子circRNA宿主基因功能分析

本研究為探究內(nèi)含子circRNA宿主基因的功能，分析了6個對照組中22個差異表達的ciRNA(表4)。其中ciRNA450的宿主基因100 860 901富集在Wnt信號通路中；ciRNA587的宿主基因102 189 934富集在Mapk信號通路中(表5)，而Wnt 信號通路和Mapk信號通路是毛囊發(fā)生發(fā)育相關的重要通路，推測ciRNA可能通過調(diào)控其宿主基因的表達來影響毛囊的發(fā)生發(fā)育。

表4 絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育差異表達的內(nèi)含子circRNA統(tǒng)計Table 4 Statistics of intron circRNA differentially expressed during hair follicle development in the fetal period of cashmere goats

表5 絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育內(nèi)含子circRNA宿主基因富集的KEGG通路Table 5 KEGG pathway enriched in circRNA host genes in the development of fetal hair follicles in cashmere goats

3 討 論

3.1 絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育相關circRNA結(jié)構(gòu)

毛囊的發(fā)生發(fā)育受到多種信號通路分子的調(diào)控，除了眾多編碼RNA外，非編碼也是調(diào)控毛囊發(fā)生發(fā)育的重要因子，包括miRNA、lncRNA和circRNA，但circRNA在毛囊的發(fā)生發(fā)育中調(diào)控作用的研究還相對匱乏。因此，本研究根據(jù)課題組前期研究結(jié)果，篩選出4個絨山羊毛囊發(fā)生發(fā)育相關的circRNA，進一步運用生物信息學分析出這4個長度分別為536、791、265和333 bp，這與Li等[17]在綿羊circRNA測序中鑒定到circRNA長度在200～400 bp的結(jié)果基本一致。同時，篩選的4個circRNA均由不同個數(shù)的外顯子組成，均為外顯子circRNA。與Li等[18]在circRNA的鑒定中發(fā)現(xiàn)外顯子circRNA占80%以上的研究結(jié)果相符。qRT-PCR表明篩選的4個circRNA均為差異表達的circRNA，組間差異分析發(fā)現(xiàn)部分結(jié)果與測序結(jié)果不一致，但整體表達趨勢一致，推測可能與實驗誤差有關。

3.2 絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育相關內(nèi)含子circRNA功能預測

全部由內(nèi)含子環(huán)化而成的circRNA稱內(nèi)含子circRNA，這些ciRNAs通常定位于細胞核中，而它們的親本基因主要定位在細胞質(zhì)中。研究表明，環(huán)狀RNA可以通過與線性轉(zhuǎn)錄本競爭性剪接，從而影響宿主基因的表達[4]。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子環(huán)狀RNA能順式調(diào)控宿主基因的表達。本研究對前期測序結(jié)果中22個差異表達的內(nèi)含子環(huán)狀RNA的宿主基因富集情況進行整合，發(fā)現(xiàn)部分宿主基因富集在Wnt和Mapk信號通路中，其中100 860 901基因富集于Wnt信號通路中。Wu等[20]篩選了Wnt信號通路中Wnt10A，驗證發(fā)現(xiàn)對絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育有調(diào)控作用，馬森等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin 通路與絨山羊絨毛周期性再生相關，并且能夠促進絨毛的快速生長，另外發(fā)現(xiàn)Wnt蛋白是胎兒毛囊發(fā)育啟動的最早信號之一[22]；102 189 934基因是本研究中富集到MAPK通路中的基因。研究顯示，Tβ4能夠影響β-catenin的表達，通過誘導VEGF及MMP-2的表達，使得MAPK中P38的激活，進而影響了毛囊分布和毛干數(shù)量[23]；另外研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控毛囊周期的一些蛋白受MAPK信號激活，腫瘤壞死因子(TNF)作為MAPK信號中的重要成員之一，對毛囊的細胞凋亡有重要作用[24]。因此，推測內(nèi)含子circRNA可能通過調(diào)控宿主基因的表達來影響毛囊的發(fā)生發(fā)育。

3.3 絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育相關外顯子circRNA功能預測

全部由外顯子環(huán)化而成的circRNA為外顯子circRNA。外顯子circRNA主要定位于細胞質(zhì)中，近年來，有大量的研究發(fā)現(xiàn)定位于細胞質(zhì)中的circRNA可以和mRNA競爭miRNA的靶標結(jié)合位點，從而調(diào)控mRNA的表達[25]。研究表明Notch 信號和毛囊的形態(tài)發(fā)生有直接的關系[26]。本研究篩選到了絨山羊胎兒期毛囊發(fā)生發(fā)育關鍵基因Notch2和DLL4，而先前研究中也發(fā)現(xiàn)Notch2對調(diào)節(jié)羊絨細度具有潛在的重要意義[27]，DLL4與羊毛囊發(fā)育相關[28]。TGF-β信號通路同樣是毛囊發(fā)育相關的重要通路，本研究中篩選到TGF-β信號通路中的FBLN5對毛發(fā)生長有影響[29]，本課題組Han等[30]研究表明chi-miR-199a-5p通過調(diào)控TGF-β信號通路中的TGF-β2來調(diào)控次級毛囊的發(fā)生發(fā)育通路，另外研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1對小鼠毛囊退行期有調(diào)控作用，敲除TGF-β1小鼠生長期向退行期的轉(zhuǎn)變明顯延遲[31]，TGF-β2可以抑制毛干的延長并誘導毛囊退行期的形態(tài)學改變[32]，TGF-β2可能通過調(diào)控內(nèi)源性的細胞凋亡引起毛囊角質(zhì)形成細胞的凋亡，進而抑制毛發(fā)的生長[33]。本研究預測關鍵circRNA靶向miRNA以及靶向miRNA的靶基因，同時部分靶基因富集在Notch和TGF-β信號通路中。當然，circRNA對Notch和TGF-β信號通路調(diào)控的研究也相對較多，但主要集中在人類疾病的研究上。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的環(huán)狀RNA hsa_circ0067301通過miR-141/Notch信號通路調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜異位癥上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[34]；CircNFIX可通過Notch信號通路介導miR-34a-5p，調(diào)控NOTCH1和Notch信號通路，促進膠質(zhì)瘤的發(fā)生[35]；CircAPLP2通過靶向miR-101-3p激活Notch信號通路調(diào)控結(jié)直腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移[36]。circRNA010567通過靶向TGF-β1抑制miR-141促進心肌纖維化[37]；circRNAcESRP1通過分泌miR-93-5p 抑制TGF-β通路在小細胞肺癌化療敏感性中起著關鍵作用，提示cESRP1可能是一個有價值的預后生物標志物和潛在的小細胞肺癌治療靶點[38]；hsa_circ0001085可能通過hsa-miR-196b-5p間接調(diào)節(jié)TGF-β信號通路從而對前列腺癌細胞起調(diào)節(jié)作用[39]。因此，認為外顯子circRNA主要通過circRNA-miRNA-mRNA途徑調(diào)控毛囊的發(fā)生發(fā)育。

4 結(jié) 論

本研究篩選了絨山羊毛囊發(fā)生發(fā)育關鍵circRNA并發(fā)現(xiàn)在山羊胎兒期毛囊發(fā)育各階段存在差異；外顯子circRNA主要通過競爭性結(jié)合miRNA以circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡來調(diào)控毛囊的發(fā)生發(fā)育；22個內(nèi)含子circRNA的宿主基因可能通過Wnt和Mapk等信號通路調(diào)控毛囊的發(fā)生發(fā)育。本研究為解析circRNA在絨山羊毛囊發(fā)生發(fā)育中的分子機制奠定了基礎，也為絨山羊分子輔助育種提供了理論依據(jù)。