崔韶麗，張維佳，邵學(xué)廣，2，蔡文生

（1.南開大學(xué)分析科學(xué)研究中心,有機(jī)新物質(zhì)創(chuàng)造前沿科學(xué)中心,化學(xué)學(xué)院,天津市生物傳感與分子識別重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.藥物化學(xué)生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300071）

抗凍蛋白（Antifreeze proteins，AFPs），又稱為冰結(jié)合蛋白，是一類能控制冰晶生長和抑制冰晶重結(jié)晶的蛋白質(zhì)，可以保護(hù)生物體在零度以下的環(huán)境中生存［1，2］.AFPs主要存在于昆蟲、微生物、植物和魚類等生物體內(nèi)［3，4］.通常，昆蟲AFPs和微生物AFPs被認(rèn)為是超活性抗凍蛋白，而植物AFPs和魚類AFPs則被認(rèn)為是中等活性抗凍蛋白［5，6］.AFPs由于具有優(yōu)異的抗凍性能被應(yīng)用于組織和器官及食品工業(yè)的低溫保存領(lǐng)域［7，8］，因此AFPs抗凍機(jī)制［5，6，9］和其中的AFPs與冰-水界面相互作用［10，11］吸引了不少研究者的興趣.

近年來，研究者們提出錨定包合物模型來描述AFPs與冰-水界面的結(jié)合［12，13］.該模型認(rèn)為AFPs通過攜帶自己的“冰”（即錨定包合水，Anchored clathrate water，ACW）與冰晶結(jié)合，即在冰結(jié)合位點(diǎn)（Icebinding site，IBS）通過疏水作用使液態(tài)水分子按晶格方式排列，并通過氫鍵錨定液態(tài)水分子晶格，錨定的液態(tài)水分子晶格又通過匹配特定的冰面使AFPs與冰晶結(jié)合.Garnham等［12］認(rèn)為該模型適用于任何的AFP，不論其抗凍活性水平如何.超活性昆蟲抗凍蛋白（Hyperactive insect AFPs，hypAFPs），如TenebriomolitorAFP（TmAFP），Choristoneura fumiferanaAFP等的IBS具有平整的結(jié)構(gòu)且含有較多的蘇氨酸殘基（Thr），IBS基序?yàn)門hr-x-Thr（TxT，x是非保守的氨基酸，主要是疏水氨基酸）.通過Thr殘基的兩親性基團(tuán)錨定與冰結(jié)合［14，15］，吸附在冰晶的基面和至少一面與基面正交的晶面.蘇氨酸重復(fù)距離和基面氧原子重復(fù)距離形成完美匹配［圖1（A）］［13，16］.Scotter等［17］發(fā)現(xiàn)能夠與基面結(jié)合是AFPs具有超活性的基礎(chǔ).Bar等［18］對TmAFP的突變研究表明IBS上Thr被絲氨酸或纈氨酸取代，其活性會降低很多，說明Thr在蛋白與冰晶相互識別和結(jié)合過程中起到很重要的作用［19］.中等活性黑麥草抗凍蛋白（Lolium perenneAFP，LpAFP）與TmAFP的尺寸相似［圖1（B）］［20］，其IBS也具有疏水且平整的結(jié)構(gòu)，與冰晶基面結(jié)合，卻具有中等的抗凍活性.然而，如果突變野生型LpAFP的IBS使其具有較多的Thr和具有完美Thr-x-Thr結(jié)構(gòu)，其與冰結(jié)合的能力和活性水平還需要進(jìn)一步明確.

Fig.1 Schematic representation of Tm AFP(PDB ID:1EZG)aligned to the basal plane of ice(A),crystal structures of Tm AFP and Lp AFP(PDB ID:3ULT)(B)

分子動力學(xué)（Molecular dynamics，MD）模擬是在原子水平上揭示分子之間相互作用機(jī)制的一種常用而有效的方法［21~26］.如Hudait等［27］利用MD模擬研究了超活性抗凍蛋白TmAFP冰結(jié)合位點(diǎn)處的氫鍵和疏水基團(tuán)對TmAFP-冰結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)，結(jié)果表明，AFPs與冰結(jié)合時氫鍵和疏水基團(tuán)同等重要，Mochizuki等［28］觀察到抗凍糖蛋白通過疏水基團(tuán)與冰可逆地結(jié)合，Hudait等［13］還計算了TmAFP與冰面的結(jié)合自由能，發(fā)現(xiàn)其與冰晶基面結(jié)合能力最強(qiáng).本文通過突變LpAFP的IBS上的部分非蘇氨酸殘基，將其IBS上蘇氨酸含量逐步增加，其中包括一個使每個β片段均具有TxT基序的突變，利用MD模擬LpAFP及其突變體與冰晶的結(jié)合，并進(jìn)一步計算結(jié)合過程的自由能曲線來研究了Thr含量對其吸附冰晶能力和抗凍活性的影響.

1 理論和方法

1.1 模型建立

從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中獲得LpAFP的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：3ULT），利用CHARMM-GUI［29］建立4個LpAFP突變體的結(jié)構(gòu)，每個突變體中突變的殘基如表1所示，突變的目標(biāo)氨基酸均為蘇氨酸.目的是逐步提高蘇氨酸的含量.所有冰的模型都是利用GenIce［30］軟件生成.構(gòu)建的帶有周期性邊界條件的AFP-冰-水模型如圖2（A）所示，AFP的IBS距離冰晶基面為1 nm，且IBS上兩排氨基酸平行于冰晶基面的a1軸［圖2（B）］，每個體系中加入3個Na+作為抗衡離子，為了避免其對水結(jié)冰動力學(xué)的影響，將其約束在盒子的邊緣［31］.為了防止冰晶的融化，將冰晶約束在初始的位置，力常數(shù)均為1000 kJ·mol?1·nm?2.所建模型的細(xì)節(jié)見表1.

Table 1 Details of the molecular assemblies investigated in this study

Fig.2 Lp AFP/mutant?ice?water assemblies for MD(A),schematic diagram of the a?axis of ice(B)and Lp AFP/mutant?ice?water assemblies for free?energy calculations(C)

1.2 動力學(xué)模擬

所有MD模擬均采用GROMACS 2020.2軟件［32］，使用CHARMM27力場［33］參數(shù)描述AFPs，使用TIP4P/ICE模型［34］中的參數(shù)描述水分子，根據(jù)文獻(xiàn)［26，35］報道，CHARMM27力場和TIP4P/ICE水模型相結(jié)合可用于描述AFPs的吸附過程.使用V-rescale［36］和Parrinello-Rahman［37］控制溫度和壓強(qiáng)分別為268 K和1×105Pa.采用LINCS算法［38］將所有涉及氫原子的共價鍵限制在其平衡長度.用2 fs時間步長對運(yùn)動方程進(jìn)行積分，范德華和短程靜電相互作用的截斷半徑為1.2 nm，長程靜電相互作用采用粒子網(wǎng)格埃瓦爾德（Particle Mesh Ewald，PME）方法［39］計算.首先采用最速下降算法，使每個體系的初始能量最小化50000步.然后，在正則系綜（NVT）中進(jìn)行了100 ps模擬，在等溫等壓系綜（NPT）中進(jìn)行了100 ps模擬，最后在NPT系綜中進(jìn)行了400 ns的MD模擬.使用VMD 1.9.3［40］進(jìn)行MD軌跡的可視化和分析.

1.3 自由能計算

自適應(yīng)偏置力（ABF）［41，42］方法是一種基于熱力學(xué)積分的重要采樣方法，通過施加在由集合變量構(gòu)成的反應(yīng)坐標(biāo)方向上的偏置力來增強(qiáng)該方向上的采樣，具有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)氖諗啃?，但是在使用中存在很多局限，如該方法需要?shí)現(xiàn)集合變量間的相互獨(dú)立，并與體系中存在的約束正交等大大限制了其在復(fù)雜體系中的應(yīng)用.因此，我們［43］實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)展自適應(yīng)偏置力（eABF）的計算方法基本解決了經(jīng)典ABF方法的缺點(diǎn).本文采用本課題組最新發(fā)展的WTM-eABF方法［44，45］來計算AFPs與冰結(jié)合過程的自由能曲線，該方法結(jié)合了Well-tempering metadynamics［46，47］和eABF［43，48］“填谷”和“削峰”的優(yōu)點(diǎn)，極大地提高了采樣效率，并已得到了廣泛應(yīng)用［44，49］.從平衡軌跡中獲得AFP吸附時的構(gòu)象來構(gòu)建如圖2（C）所示的模型，用于利用WTM-eABF方法計算AFP與冰晶基面可逆吸附的自由能變化.為了防止冰的生長造成吸附過程的不可逆，將溫度控制在280 K（高于熔點(diǎn)10 K）［28］.另一方面，為了防止冰晶的融化，將冰晶約束在其初始的位置，力常數(shù)為1000 kJ·mol?1·nm?2.選擇AFPs的質(zhì)心與冰中氧原子的質(zhì)心之間的距離在y軸（即沿冰生長的方向）上的投影作為吸附過程的反應(yīng)坐標(biāo)d（其取值范圍為1.9 nm≤d≤3.3 nm）.用來計算自由能的每個體系模擬時間為800 ns，總的模擬時間為2.4μs.

2 結(jié)果與討論

2.1 Lp AFP及其突變體IBS周圍液態(tài)水分子的分布

液態(tài)水分子的分布對AFPs與冰的結(jié)合具有較大的影響，為了分析LpAFP及其突變體IBS周圍液態(tài)水分子的分布情況，計算了水分子相對于IBS氨基酸的徑向分布函數(shù)，如圖3（A）所示.可見，LpAFP和不同突變體對峰的位置和形狀無明顯的影響，但峰的高度變化明顯.蘇氨酸越多其周圍液態(tài)水分子分布就越多.這一結(jié)果表明提高IBS上蘇氨酸的含量有助于結(jié)合更多的水分子，與已報道的蘇氨酸的甲基形成疏水水籠，羥基形成氫鍵錨定水分子的結(jié)論吻合［13，15，27］，進(jìn)而可能有利于抗凍蛋白與生長的冰晶相結(jié)合.

Fig.3 Radial distribution function of water(oxygen atoms)around the IBS of Lp AFP and its mutants obtained from MD simulations(A),hydrogen bond lifetime correlation functions between any water molecules and amino acid residues at the IBS for wild?type Lp AFP and its mutants adsorbed on ice crystals(B)

2.2 Lp AFP及其突變體的ACW穩(wěn)定存在時間的比較

ACW的穩(wěn)定存在主要依靠AFPs與冰晶之間形成的氫鍵［50］.為了研究LpAFP及其突變體形成的ACW的穩(wěn)定性差異，計算了AFP吸附在冰晶上時，IBS的殘基與所有水分子（包含新生長的冰）之間的氫鍵壽命自相關(guān)函數(shù)C（t）［51］，定義如下：

當(dāng)冰結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸和所有水分子（包含新生長的冰）之間存在氫鍵時，h（t）為1；當(dāng)不存在氫鍵時，h（t）為0.這種自相關(guān)函數(shù)可以反映氫鍵能夠維持的時間以及隨時間的衰減速度，結(jié)果如圖3（B）所示.可見，隨著IBS上蘇氨酸數(shù)量的增多，C（t）衰減速度減慢，其中突變體4的C（t）衰減速度最慢，說明其與冰晶形成氫鍵的穩(wěn)定性最強(qiáng).結(jié)果表明，蘇氨酸的含量越高，越有利于氫鍵的形成.

2.3 自由能的比較

根據(jù)前面的分析，如果IBS上具有完美重復(fù)的TxT基序（Mutant 4），推測其與冰晶的結(jié)合力最強(qiáng).為了進(jìn)一步證明此結(jié)論，選擇了Mutant 2，Mutant 4和LpAFP為例，計算了它們與冰結(jié)合過程的自由能曲線，并分析了吸附時IBS與冰晶表面形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò).圖4（A）給出了描述LpAFP及其突變體2和4與冰晶結(jié)合過程的自由能曲線.可見，IBS上蘇氨酸含量越高，AFPs與冰晶的結(jié)合能力越強(qiáng)，且具有規(guī)整TxT基序時與冰晶的結(jié)合能力顯著增強(qiáng).推測這是由于蘇氨酸上甲基形成了疏水水籠［圖4（A）插圖］，羥基形成氫鍵錨定液態(tài)水分子，且IBS上蘇氨酸重復(fù)距離與冰晶基面重復(fù)氧原子之間距離相匹配［13，16］，使得粘合AFP與冰面的氫鍵網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性明顯增強(qiáng).Chakraborty等［52］計算了野生型AFPIII及其幾個突變體與冰的結(jié)合自由能，發(fā)現(xiàn)結(jié)合自由能的大小與實(shí)驗(yàn)觀察到的熱滯活性高低呈線性相關(guān)，因此推測圖4（A）中抗凍活性高低順序?yàn)镸utant 4>Mutant 2>LpAFP.圖4（B）~（D）為自由能曲線隨模擬時間的演化，表明了在800 ns內(nèi)計算已經(jīng)收斂.

Fig.4 Free?energy profiles characterizing the adsorption process for Lp AFP,Mutant 2 and Mutant 4(A),free?energy profiles at different simulation times for the Lp AFP(B),Mutant 2(C)and Mutant 4(D)

2.4 Lp AFP及其突變體吸附在冰面時形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)的比較

為了更直觀地展示突變體與冰晶結(jié)合能力的提高，對IBS周圍0.5 nm之內(nèi)水分子與IBS的氨基酸、通道水分子（Channel water，CW）形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了分析，如圖5所示.其中，CW是ACW的一部分，參與AFPs與冰結(jié)合時形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò).可見，野生型的LpAFP雖然可以吸附在冰晶的基面，但是CW個數(shù)較少，與冰結(jié)合時形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)不完整，所以其結(jié)合能力并不強(qiáng)［圖5（A）］.突變體2形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)已較為完整［圖5（B）］，突變體4則可以形成緊密完整的氫鍵網(wǎng)絡(luò)［圖5（C）］，CW個數(shù)較多且從模擬軌跡上可以看出其穩(wěn)定存在的時間變長，CW的穩(wěn)定存在為突變體與冰晶的強(qiáng)結(jié)合提供了基礎(chǔ)［50］.總之，蘇氨酸含量越高，其IBS與冰面之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)也越穩(wěn)定，且具有規(guī)整TxT重復(fù)基序會使形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)最穩(wěn)定.

Fig.5 Hydrogen bond structures of water molecules within 0.5 nm below the IBS of Lp AFP(A),Mutant 2(B)and Mutant 4(C)adsorbed on ice crystals

3 結(jié) 論

利用分子動力學(xué)模擬結(jié)合自由能計算的方法，比較了中等活性LpAFP的IBS蘇氨酸含量對其與冰晶結(jié)合能力的影響.結(jié)果表明，IBS上蘇氨酸含量越高，LpAFP與冰晶的結(jié)合在能量上越有利；當(dāng)突變IBS使其具有與hypAFP相同的TxT基序時，其與冰的結(jié)合能力最強(qiáng).進(jìn)一步探究了其與冰晶結(jié)合能力增強(qiáng)的原因，結(jié)果表明，IBS周圍液態(tài)水分子分布隨蘇氨酸含量的增加而增強(qiáng).進(jìn)一步分析了ACW穩(wěn)定存在的時間和IBS與冰面之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)都表明AFPs與冰晶的結(jié)合能力隨蘇氨酸含量的增加而更穩(wěn)定.由此得出，增加蘇氨酸的含量是提高中等活性抗凍蛋白抗凍活性的有效方法.研究結(jié)果為冰生長抑制劑的設(shè)計提供了一套計算方法和理論指導(dǎo).