張莉娟，谷新晰，孫記錄，田洪濤，盧海強(qiáng)

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北 保定 071001）

雷山魚醬酸是貴州黔東南苗族自治州雷山縣的傳統(tǒng)調(diào)味品，是以鮮紅椒與當(dāng)?shù)匾吧郁~為主要原料，配以食鹽、生姜、白酒、醪糟、香辛料等輔料，采用傳統(tǒng)的密閉發(fā)酵制成。魚醬酸雖有悠久的加工及食用歷史，但是其研究大多停留在生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范[1]、加工工藝[2]、營養(yǎng)成分、礦物質(zhì)、有機(jī)酸和辣椒堿等方面[3]。目前影響魚醬酸發(fā)酵的微生物區(qū)系及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等還不清楚，尚缺乏全面、系統(tǒng)的研究，因而限制了雷山魚醬酸的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。

我國是農(nóng)業(yè)大國，以農(nóng)產(chǎn)品作為食物的重要來源，農(nóng)產(chǎn)品發(fā)酵是我國食品加工的重要技術(shù)來源之一。因發(fā)酵過程中多種微生物的存在，導(dǎo)致一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，使產(chǎn)品特性品質(zhì)不一[4]。目前，高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種發(fā)酵食品中的微生物種類多樣性的研究，如馬冰濤等[5]采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)老白干香型大曲中的微生物進(jìn)行測(cè)序，通過調(diào)控對(duì)風(fēng)味成分貢獻(xiàn)較大菌屬來提高白酒品質(zhì)；Liu 等[6]研究了錦州蝦醬發(fā)酵過程中，細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)變化與揮發(fā)性物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的相互關(guān)系，探索微生物菌群與揮發(fā)性物質(zhì)之間的影響；于美娟等[7]探討固態(tài)發(fā)酵魚中細(xì)菌群落多樣性與品質(zhì)的關(guān)系，揭示樣品中細(xì)菌數(shù)量和結(jié)構(gòu)組成與品質(zhì)的相關(guān)性，以控制加工條件。

固相微萃取（SPME）能夠減少風(fēng)味物質(zhì)的散失[8]，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣為一體，保證了食品風(fēng)味的完整性，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味物質(zhì)的定性、定量分析中。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GCMS）可對(duì)復(fù)雜有機(jī)化合物進(jìn)行有效分離和定性[9-11]，作為分析揮發(fā)性物質(zhì)的有效工具，具有操作簡(jiǎn)便、高效、靈敏度高等特點(diǎn)。采用SPME-GC-MS 方法分析魚醬酸中揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)樣品進(jìn)行全面觀察，以達(dá)到微觀分析與宏觀處理相結(jié)合的風(fēng)味物質(zhì)綜合分析。

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)分析雷山魚醬酸細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)解析魚醬酸中的風(fēng)味成分，探究其主要微生物、關(guān)鍵揮發(fā)性成分及品質(zhì)特性，為雷山魚醬酸的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雷山魚醬酸，貴州省雷山縣永樂冷府魚醬酸食品有限責(zé)任公司。

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品：酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、丁二酸、富馬酸，成都市科龍化工試劑廠；17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸，Agilent 公司；內(nèi)標(biāo)正亮氨酸和異硫氰酸苯酯 （PITC），美國Sigma-Aldrich 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微萃取裝置，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；QP2010Plus 氣相色譜質(zhì)譜儀，日本島津公司；JW-3021H 臺(tái)式高速離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司；高效液相色譜儀，惠州市華高儀器設(shè)備有限公司；高速均質(zhì)器，上海力辰科技公司；高速粉碎機(jī)，上海力辰科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 微生物群落的高通量測(cè)序分析

1.3.1.1 基因組DNA 提取和PCR 擴(kuò)增 采取雷山魚醬酸樣品10 g 于5 000×g 離心10 min，根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]中的CTAB 法并作修改，提取魚醬酸中的DNA。采用NEB 公司的Q5 高保真DNA 聚合酶，對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3-V4 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增[13]，細(xì)菌V3-V4F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA，細(xì)菌V3-V4R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。擴(kuò)增體系（50 μL）：5×reaction buffer 10 μL，5×GC buffer 10 μL，d NTP （2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物 （10 μmol/L）1 μL，DNA模板2 μL，dd H2O 23 μL，Q5 DNA 聚合酶1 μL。擴(kuò)增參數(shù)：預(yù)變性94 ℃5 min；變性94 ℃30 s，退火55 ℃30 s，延伸72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)；終延伸72 ℃10 min。

1.3.1.2 Illumina Miseq 測(cè)序 使用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（Biomed）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。利用熒光試劑Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，在酶標(biāo)儀（BioTek，F(xiàn)Lx800）定量?jī)x器上對(duì)PCR 擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量。采用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制備測(cè)序文庫，并采用Agilent High Sensitivity DNA Kit 進(jìn)行質(zhì)檢，確保制備的文庫有且只有單一的峰，且無接頭。使用MiSeq Reagent Kit V3（600 個(gè)循環(huán)）試劑在MiSeq 測(cè)序儀上對(duì)目的片段進(jìn)行雙端測(cè)序，為保證測(cè)序質(zhì)量，建議目標(biāo)片段的最佳測(cè)序長(zhǎng)度為200～450 bp[14-15]。

1.3.1.3 數(shù)據(jù)處理 測(cè)序得到的原始雙端測(cè)序數(shù)據(jù)，以FASTQ 格式保存。在原始數(shù)據(jù)中存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)，為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，采用DADA2 方法得到有效數(shù)據(jù)[16]。即運(yùn)用QIIME 2 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去引物、質(zhì)量過濾、去噪、拼接、去嵌合體，以100%相似度聚類（或稱去重）。經(jīng)過DADA2 質(zhì)控后產(chǎn)生的去重的序列稱為ASVs（Amplicon sequence variants），或稱為特征序列，而這些序列在樣本中的豐度表稱為特征表。最后基于上述分析結(jié)果，運(yùn)用QIIME 2 軟件和R 語言ggplot2 包進(jìn)行物種水平上組成成分分析和可視化，進(jìn)行Alpha 多樣性分析[17]。

1.3.2 魚醬酸中揮發(fā)性物質(zhì)的測(cè)定

1.3.2.1 頂空固相微萃取進(jìn)樣 參照盧靖等[18]的方法，取2 g 樣品加入到20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，密封。60 ℃水浴加熱，平衡10 min，將75 μmol/L PDMS/CAR 萃取頭插入進(jìn)樣瓶頂空萃取。頂空吸附30 min 后，插入GC 進(jìn)樣口解吸5 min。

1.3.2.2 GC-MS 分析 色譜條件：色譜柱DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min。升溫程序：起始溫度32 ℃，保持5 min；然后以4 ℃/min 的速率升溫到130 ℃；最后以10 ℃/min 的速率升溫到200 ℃。進(jìn)樣口溫度250 ℃。

質(zhì)譜條件：電子電離（Electron ionization，EI），電子轟擊能量為70 eV，掃描范圍40～350 m/z[18]。離子源溫度230 ℃。

利用計(jì)算機(jī)NIST 譜庫進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索，各組分相對(duì)含量按峰面積歸一化法計(jì)算[19]。

1.3.3 魚醬酸中有機(jī)酸的測(cè)定 根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品有機(jī)酸的測(cè)定》（GB 5009.157-2016）[20]中的方法，進(jìn)行雷山魚醬酸中有機(jī)酸的測(cè)定。

1.3.4 雷山魚醬酸中脂肪酸的測(cè)定 根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》（GB 5009.168-2016）[21]中內(nèi)標(biāo)法的方法，對(duì)雷山魚醬酸中的脂肪酸進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 雷山魚醬酸中氨基酸的測(cè)定 用氨基酸液相自動(dòng)分析儀對(duì)雷山魚醬酸中的氨基酸酸進(jìn)行測(cè)定。參照Zeng 等[22]的方法并稍做改動(dòng)，對(duì)雷山魚醬酸的樣品進(jìn)行處理。流動(dòng)相的配比和游離氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)品可參照華倩[23]的方法并稍做修改，通過與游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品相比，根據(jù)保留時(shí)間和峰面積來計(jì)算含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物多樣性分析

2.1.1 微生物的Alpha 多樣性分析 通過細(xì)菌V3-V4 測(cè)序，獲得115 616 個(gè)序列。運(yùn)用QIIME2軟件進(jìn)行DADA2 去噪后，獲得102 586 個(gè)序列。所得序列在100%的相似水平下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得1 515 個(gè)ASVs。

Coverage 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)分別用于評(píng)估魚醬酸樣品中物種的測(cè)序深度、豐度和分布多樣性[24]。Coverage 指數(shù)越高，表明樣本中序列數(shù)據(jù)測(cè)出越全面；Chao1 指數(shù)與樣品中微生物群落豐度成正相關(guān)；Shannon 指數(shù)則與樣品微生物多樣性有關(guān)，數(shù)值越大，微生物種類越豐富。由表1可知，雷山魚醬酸樣本中微生物Coverage 指數(shù)大于0.99，說明樣品文庫中序列基本上都被測(cè)出，可進(jìn)行魚醬酸樣品中大部分微生物多樣性的分析，也為后期研究雷山魚醬酸深層次的生物信息學(xué)提供了可信度。

表1 雷山魚醬酸菌群微生物多樣性指數(shù)Table 1 Microbial diversity index of Thunder mountain fish sauce acid

2.1.2 雷山魚醬酸中不同水平細(xì)菌群落組成分析 根據(jù)對(duì)雷山魚醬酸樣品的測(cè)序結(jié)果分析可知，樣品中共有22 個(gè)細(xì)菌門被檢出，其種類豐富度較高，所占總序列數(shù)差異大。由圖1a（僅展示了前20個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門的含量）可知，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）是魚醬酸中的優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度分別為39.13%和30.68%，占據(jù)菌群總量69.81%。其余為放線菌門（Actinobacteria，17.47%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，8.09%）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria，1.464%）、軟壁菌門（Tenericutes，1.226%）、棲熱菌門（Deinococcus-Thermus，0.465%）等。近年來，許多研究表明厚壁菌門和變形菌門微生物是高蛋白食品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，在乳制品[25]、肉制品[26]及水產(chǎn)品中都十分常見[27-28]，與本研究結(jié)果一致。劉洋等[29]對(duì)四川辣椒醬的研究中，探尋出變形菌門是發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)菌門，厚壁菌門是辣椒醬發(fā)酵中、后期的優(yōu)勢(shì)菌門。在Zang等[30]對(duì)中國傳統(tǒng)發(fā)酵魚酸魚發(fā)酵過程中微生物群落演替的動(dòng)態(tài)和多樣性的研究中，也發(fā)現(xiàn)了變形菌門、厚壁菌門是酸魚發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。在屬的水平上，樣品共檢出249 個(gè)細(xì)菌屬。如圖1b 所示（只展示了前20 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬的含量），節(jié)桿菌屬 （Arthrobacter，11.246%）、雷爾氏菌屬（Ralstonia，10.929%）為樣品的優(yōu)勢(shì)菌群，另外瘤胃菌屬（Ruminococcaceae UCG-014，7.343%）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum，6.639%）、乳桿菌屬（Lactobacillus，5.443%）、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas，4.945%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，4.402%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，4.214%）、弧菌屬（Vibrionimonas，3.635%）、毛螺旋菌屬（Lachnospiraceae，1.939%）等也具有一定的豐富度。節(jié)桿菌屬可從葡萄糖或其它糖中產(chǎn)生少量酸或不產(chǎn)酸，有的不抗酸。雷爾氏菌對(duì)含鉀酸鹽礦物也有較強(qiáng)的分解能力[31]。假單胞菌屬的細(xì)菌多具有分解蛋白質(zhì)和脂肪的能力，耐鹽性的特性讓其具有生存優(yōu)勢(shì)。然而也有報(bào)道證明假單胞菌屬會(huì)導(dǎo)致腹瀉[32]。乳桿菌屬為兼性厭氧菌，廣泛分布于自然界中，污染乳制品、肉制品、水產(chǎn)品等高蛋白食品后可引起腐敗變質(zhì)。雷山魚醬酸樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬與之前報(bào)道過的中國傳統(tǒng)發(fā)酵魚酸魚發(fā)酵過程中微生物的優(yōu)勢(shì)菌屬不同，酸魚主要優(yōu)勢(shì)菌屬以乳酸菌（Lactococcus）、大球菌（Macrococcus）和葡萄球菌（Staphylococcus）為主，可能是因?yàn)樗狒~在發(fā)酵過程中以自發(fā)酵為主[33]。傳統(tǒng)韓國發(fā)酵魚露（Myeolchi-aekjeot，MA）的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與本研究中觀察到的也不同，在發(fā)酵過程中，以四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）和鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）為主，這種變化主要是由于鹽度條件，因?yàn)樵诟啕}度下的魚醬發(fā)酵導(dǎo)致各種嗜鹽或耐鹽微生物的發(fā)展[34]。

圖1 雷山魚醬酸中的微生物在門和屬水平的分布情況Fig.1 Distribution of microorganisms in Lei Shan fish sauce acid at phylum level and genus level

2.2 GC-MS 鑒定雷山魚醬酸揮發(fā)性成分

由表2可知，雷山魚醬酸樣品中檢出揮發(fā)性成分60 余種。主要揮發(fā)性成分包括萜烯類、醚類、醇類、酸類、酯類，各占揮發(fā)性成分總量的33.65%，33.53%，16.45%，7.82%，6.47%。還有微量揮發(fā)性成分，包括芳香族類（0.6%）、酮醛類（0.65%）、烷烴類（0.22%）等物質(zhì)。萜烯類、醚類是魚醬酸中主要的揮發(fā)性物質(zhì)，對(duì)魚醬酸風(fēng)味物質(zhì)有巨大貢獻(xiàn)。本研究檢出的多種萜烯類化合物，大多數(shù)來自于香辛料[35]和辣椒[36]。這類烯烴氣味強(qiáng)烈，閾值較低，在魚醬酸風(fēng)味的形成過程中提供巨大貢獻(xiàn)。且右旋萜二烯（13.12%）、α-姜黃烯（2.71%）、姜烯（2.41%）等的相對(duì)含量較高。右旋萜二烯香氣檢出閾值4～229 μg/kg，呈甜的甜橙和柑橘類風(fēng)味。蒎烯、香橙烯這些烯烴類物質(zhì)不僅可以賦予魚醬酸柑橘香味，在品質(zhì)提升方面也有很大幫助。含量較高的姜烯、α-姜黃烯可能與魚醬酸制作過程中添加的生姜有密切關(guān)系，其它萜烯類成分的來源可能是加工過程中添加的輔料，如大料、肉桂、花椒、丁香和砂仁等[37]，是促進(jìn)魚醬酸風(fēng)味形成的主要物質(zhì)。羅勒烯具有青香、熱帶果香、菇香、辛香香味、草藥味[38]。

表2 雷山魚醬酸中揮發(fā)性成分及相對(duì)含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Volatile components and their relative contents in Lei Shan fish sauce sour

（續(xù)表2）

本研究中檢出的4 種醚類，其中相對(duì)含量最高的是茴香腦（23.25%），是產(chǎn)生醬香的重要物質(zhì)[37]，具有濃郁的茴香氣，略微甜味。

在此魚醬樣品中醇類的種類相對(duì)較為豐富，醇類通常具有芳香、蘑菇香、酸敗和土氣味，對(duì)魚醬的發(fā)酵有著重要作用。芳樟醇貢獻(xiàn)百合花香氣，且沸點(diǎn)低，屬于上等的天然香料；松油醇，具有紫丁香的香氣，這些醇類物質(zhì)賦予了魚醬酸溫和、純正的香氣。芳樟醇、4-萜烯醇等閾值較低，對(duì)風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)較大[39]。酸類具有醋味和酸味，是微生物發(fā)酵的主要產(chǎn)物，來源于糖類的分解或者氨基酸代謝。魚醬酸中的山梨酸具有防腐保鮮作用，可以維持魚醬酸的品質(zhì)，在食品、化妝品、農(nóng)藥、煙草等行業(yè)中都被廣泛應(yīng)用[38]。酸類物質(zhì)大部分來自于碳水化合物的分解產(chǎn)物，還有一部分來自于氨基酸的代謝產(chǎn)物。魚醬酸中酯類化合物可能是來源于原料中的小河魚被多種微生物發(fā)酵代謝，或者是在發(fā)酵過程中的產(chǎn)物酸與醇發(fā)生酯化反應(yīng)，貢獻(xiàn)食品特殊的水果香味[40]，如苯甲酸乙酯稍帶有水果氣味，也是促進(jìn)魚醬酸風(fēng)味形成的重要物質(zhì)。酮類一般是在美拉德反應(yīng)、氨基酸降解或其更深層次反應(yīng)生成，且適量的酮類會(huì)貢獻(xiàn)甜的花香和果香風(fēng)味。苯甲醛在魚類產(chǎn)品中普遍存在，表現(xiàn)為令人愉快的杏仁味，并通過Strecker 降解途徑從苯丙氨酸產(chǎn)生，或通過氧化降解途徑產(chǎn)生亞麻酸。

2.3 雷山魚醬酸產(chǎn)品品質(zhì)分析

2.3.1 雷山魚醬酸中有機(jī)酸的分析 有機(jī)酸可以在大分子物質(zhì)水解以及微生物發(fā)酵下產(chǎn)生，可以為發(fā)酵食品提供獨(dú)特的風(fēng)味[41]，改變其它風(fēng)味物質(zhì)的味感。雷山魚醬酸中的酸類物質(zhì)來源于魚醬酸發(fā)酵過程中飽和脂肪酸的氧化降解。酸類物質(zhì)既是香味物質(zhì)又是呈味物質(zhì)，能夠影響魚醬酸的酸味和甜味，從而對(duì)魚醬酸的品質(zhì)產(chǎn)生影響。經(jīng)檢測(cè)，雷山魚醬酸樣品中主要有機(jī)酸為檸檬酸，含量為269.6 mg/kg。在葉陵等[42]測(cè)定自然發(fā)酵辣椒有機(jī)酸的結(jié)果中，檸檬酸含量最高，且此研究表明辣椒中原有的檸檬酸、蘋果酸等共同賦予了傳統(tǒng)腌辣椒豐富、爽口、滋潤(rùn)的酸味，表明雷山魚醬酸中產(chǎn)生的檸檬酸也可能來自原料中的辣椒。周曉琴等[3]在以4 種代表性的魚醬酸為研究對(duì)象測(cè)其有機(jī)酸時(shí)，主要有機(jī)酸為乳酸，而且4 種不同來源的魚醬酸中乳酸含量差異顯著，導(dǎo)致這種現(xiàn)象可能是由于原料來源、環(huán)境微生物和發(fā)酵時(shí)間的不同。華倩[23]在研究中也表明魚醬酸中含有少量檸檬酸，而且適當(dāng)濃度的檸檬酸不僅可以提高產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)，還能賦予魚醬酸產(chǎn)品豐富的滋味特征。

2.3.2 雷山魚醬酸中脂肪酸的分析 脂肪酸是脂肪酸氧化的底物，可以在氧氣含量充足的情況下氧化分解生成大量能量，對(duì)產(chǎn)品呈香和人體供能至關(guān)重要。另外，脂肪酸還是食品的重要組成成分，有降血壓、降血脂、抗血栓等作用，其中不飽和脂肪酸具有預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用[43]。經(jīng)過分析，檢測(cè)出雷山魚醬酸樣品中的脂肪酸為亞油酸（0.047 g/100 g）、油酸（0.0424 g/100 g）、棕櫚酸（0.035 g/100 g）、α-亞麻酸（0.0131 g/100 g）、硬脂酸（0.00946 g/100 g）、棕櫚油酸（0.00692 g/100 g）、肉豆蔻酸（0.00484 g/100 g）。這與華倩[23]在接種微生物發(fā)酵劑對(duì)魚醬酸品質(zhì)提升的研究中測(cè)定的脂肪酸成分相似。亞油酸作為人體的2 種必需脂肪酸之一，參與生物合成類二十烷酸物質(zhì)作為前體可以合成花生四烯酸。曾有研究表明，亞油酸能參與膽固醇代謝形成亞油酸膽固醇酯，在保護(hù)心血管健康，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化方面，具有很好的作用[44]。油酸、棕櫚酸是單不飽和脂肪酸，油酸在延緩動(dòng)脈硬化上也有一定作用，對(duì)高糖和高血脂病人具有很好的保健作用[45]。棕櫚酸可以降血脂、降血壓、促進(jìn)血液微循環(huán)，從而預(yù)防和減少心血管疾病的發(fā)生[46]。肉豆蔻酸會(huì)提高血膽固醇含量，若超過一定的量則不利于人體健康。

2.3.3 雷山魚醬酸中氨基酸的分析 游離氨基酸是魚醬酸滋味的重要來源，也是揮發(fā)性風(fēng)味的重要前體物質(zhì)。由表3可知，雷山魚醬酸中游離氨基酸總量占3.91%。呈味氨基酸在口感方面起至關(guān)重要的作用，依照氨基酸呈味特征分析，雷山魚醬酸樣品中的氨基酸可分成鮮、甜和苦3 類。從表3中得出，谷氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸為雷山魚醬酸中的主要游離氨基酸。谷氨酸、天門冬氨酸對(duì)鮮味特征有直接貢獻(xiàn)作用，二者含量占總游離氨基酸的26.09%，決定了鮮味在魚醬酸呈味過程中起主導(dǎo)作用。在張文華等[47]對(duì)銀魚魚醬酸的研究中，谷氨酸和天冬氨酸含量最高，分別為0.42%和0.32%，這與本研究的檢測(cè)結(jié)果相似。對(duì)雷山魚醬酸甜味有直接貢獻(xiàn)的為絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、賴氨酸等。亮氨酸、精氨酸、纈氨酸等在苦味方面有直接影響。在魚醬酸樣品中共檢測(cè)出人體必需氨基酸6 種，其中亮氨酸含量為0.3%，是必需氨基酸含量中最高的，它可以與異亮氨酸和纈氨酸一起調(diào)節(jié)血糖，為身體組織提供能量。

表3 雷山魚醬酸中游離氨基酸的組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 The composition and percentage content of free amino acid in Lei Shan fish sauce sour

3 結(jié)論

本研究通過高通量基因測(cè)序技術(shù)，對(duì)雷山魚醬酸中微生物的多樣性和豐度進(jìn)行鑒定，研究發(fā)現(xiàn)雷山魚醬酸含有22 個(gè)細(xì)菌門，249 個(gè)細(xì)菌屬。變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）是主要的細(xì)菌門，占了魚醬酸中細(xì)菌門總數(shù)的69.81%。節(jié)桿菌屬（Arthrobacter） 和雷爾氏菌屬（Ralstonia）為魚醬酸的優(yōu)勢(shì)菌屬，占魚醬酸細(xì)菌屬中的22.18%，充分說明雷山魚醬酸中細(xì)菌屬的多樣性和豐富度較高。同時(shí)利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，共檢測(cè)出魚醬酸中的揮發(fā)性成分70 種，萜烯類、醚類、醇類、酸類、酯類這5 類主要揮發(fā)性成分的含量占揮發(fā)性成分的97.92%。并檢測(cè)出雷山魚醬酸中的主要有機(jī)酸檸檬酸為269.6 mg/kg，含量最高的脂肪酸為亞油酸（0.047 g/100 g），主要呈味氨基酸為鮮味氨基酸。本研究為雷山魚醬酸的微生物多樣性研究和風(fēng)味探究，以及品質(zhì)改良提供了科學(xué)依據(jù)，能夠豐富人們對(duì)雷山魚醬酸的現(xiàn)有認(rèn)識(shí)，同時(shí)也為魚醬酸的安全生產(chǎn)和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。