焦 雪，余 庭，方結紅，唐 標，汪 雯，蔣 晗*

（1 中國計量大學生命科學學院 浙江省海洋食品品質(zhì)及危害物控制技術重點實驗室 杭州 310018 2 浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室 杭州 310021）

抗生素因可治療細菌性疾病，并可在低劑量下促生長，故被廣泛應用乃至濫用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，由此引發(fā)了嚴重的水產(chǎn)源微生物耐藥性問題[1]。研究表明，耐藥微生物不僅能在水產(chǎn)品體內(nèi)、養(yǎng)殖環(huán)境和供應鏈等環(huán)節(jié)中殘留，還可通過食物鏈等多種途徑進一步傳遞到人體中，對人類健康造成嚴重危害[2]。

整合子因在水產(chǎn)源細菌耐藥基因快速傳播中發(fā)揮至關重要的作用而備受關注[3-4]。它是一種可以定位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或染色體上的遺傳元件，通常由5’保守末端、3’保守末端和兩者之間嵌有耐藥基因盒的可變區(qū)組成[5]。整合子既可通過位點特異性基因重組來捕獲、整合或剪切基因盒，使耐藥基因在細菌間水平轉(zhuǎn)移，也可借助接合型質(zhì)粒等可移動元件進行整體橫向傳播，從而增強細菌在抗生素等壓力下的生存適應性[6]。然而，當外界抗生素壓力解除時，整合子會成為細菌的額外負擔，其適應環(huán)境的能力可能會小于野生型菌株，這一現(xiàn)象被稱為適應性代價[7]。如果適應性代價很大，當無抗生素壓力時，耐藥細菌就無法和野生型菌株競爭，容易被淘汰。反之，如果適應性代價小，整合子既可以在無抗生素壓力時得到保留，又可以使其宿主菌很快適應外界環(huán)境中的抗生素壓力并介導耐藥基因的水平傳播[8-9]。較低的適應性代價是整合子介導耐藥基因廣泛傳播與流行的重要生物學基礎[10]。

依據(jù)氨基酸序列的不同，整合子可分為5 種類型，日常食用的水產(chǎn)品中已監(jiān)測到攜帶I 型和II 型整合子的細菌，尤以大腸桿菌居多[11-12]。其中II 型整合子發(fā)現(xiàn)時間相對較晚，因其有別于I 型整合子的獨特結構和仍未清晰的傳播機制，近年來日益受到關注[13]。然而，II 型整合子在相關宿主菌中的適應性代價尚未闡明，嚴重制約了對其在水產(chǎn)品中傳播機制的深入理解。鑒于此，本研究采集浙江省市售南美白對蝦、牡蠣和大黃魚樣品，分離鑒定大腸桿菌，分析其II 型整合子攜帶情況和結構特征，比較攜帶II 型整合子的大腸桿菌在無抗環(huán)境和抗生素亞抑制濃度下適應性代價的差異，為進一步揭示II 型整合子介導的耐藥基因在水產(chǎn)源耐藥微生物中的傳播機制奠定理論基礎，同時為打造有效的食源性致病菌耐藥防控鏈提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：2019年3月至2021年3月，從浙江省杭州市各大型超市和農(nóng)貿(mào)市場購買南美白對蝦、牡蠣和大黃魚樣品各200 份。

試劑：伊紅美藍培養(yǎng)基、LB 瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術有限公司；抗生素藥敏片，杭州微生物試劑有限公司；克隆菌株大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α 和質(zhì)控菌株大腸桿菌（E.coli）ATCC25922，中國普通微生物菌種保藏管理中心；PlatinumTMTaq 高保真DNA 聚合酶，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Ex Taq DNA 聚合酶、瓊脂糖、DNA marker、切膠回收試劑盒、細菌基因組DNA 試劑提取盒、質(zhì)粒DNA 提取試劑盒等，寶生物工程（大連）有限公司；pEASY-T1 載體，北京全式金生物技術有限公司；所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

儀器：BD AccuriC6 流式細胞儀，美國BD Biosciences 公司；Arktik PCR 儀，賽默飛世爾科技（中國） 有限公司；Allegra X-30R 高速冷凍離心機，美國Beckman 公司；電泳及凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 每份樣品用獨立無菌均質(zhì)袋封裝后，置于4 ℃保溫箱，2 h 內(nèi)低溫運輸至實驗室進行樣品前處理。無菌條件下，將樣品切碎，按1 g/mL 加入無菌生理鹽水，均質(zhì)2 min，取均質(zhì)液50 μL，接種入5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.2.2 大腸桿菌的分離與分子鑒定 將過夜培養(yǎng)的均質(zhì)液劃線接種于伊紅美藍培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取平板上具黑色中心有綠色金屬光澤的典型菌落進行PCR 分子鑒定（每份樣品挑取1 株大腸桿菌作為代表）。靶標基因為大腸桿菌特異基因uidA （Genbank ID：S69414），PCR 引物序列見表1。取過夜培養(yǎng)的待測菌液1 μL，加入30 μL Tri-HCl 緩沖液，金屬浴煮沸5 min，4 ℃冷卻2 min，12 000×g 離心2 min，取上清液用作PCR 反應DNA 模板。PCR 反應體系為：0.25 μL Ex Taq，5 μL 10×Ex Taq buffer，4 μL dNTPs，2 μL 上游引物（10 μmol/L），2 μL 下游引物（10 μmol/L），1 μL DNA 模板，35.75 μL 滅菌去離子水；反應程序：94 ℃預變性4 min，98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35 次后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 II 型整合子的分離鑒定及結構分析 通過PCR 方法檢測II 型整合酶基因intI2，分析大腸桿菌分離株攜帶II 型整合子情況。PCR 引物序列見表1，反應體系同1.2.2 節(jié)，反應程序：94 ℃預變性1 min；98 ℃變性30 s，55 ℃梯度退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

進一步分析intI2 基因陽性的大腸桿菌分離株的II 型整合子完整結構。根據(jù)II 型整合子5'-CS 和3'-CS 序列設計PCR 擴增引物P1，P2，引物序列見表1。利用Platinum 高保真混合DNA 聚合酶對II 型整合子進行PCR 擴增，反應體系：45 μL Platinum PCR SuperMix，1 μL 引 物P1（10 μmol/L），1 μL 引物P2（10 μmol/L），2 μL DNA 模板，1 μL 滅菌去離子水；PCR 反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸4 min，32 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定和切膠回收。利用GeneArt Seamless Cloning & Assembly 克隆試劑盒，將切膠回收的II 型整合子與pEASY-T1 克隆載體進行連接。連接 反應體系為：5 μL GeneArt 2×Enzyme Mix，2 μL 切膠回收產(chǎn)物，1 μL pEasy-T1 （Xho I/Bam HI），1 μL 滅菌去離子水；反應條件：室溫放置20 min 后，冰上放置2～3 min。連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆送上海生工測序。測序結果通過NCBI BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 進行比對分析，獲得II 型整合子結構。

表1 引物信息表Table 1 Primer sequences information

1.2.4 II 型整合子陽性大腸桿菌的藥敏分析 根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 推薦的Kirby-Bauer 紙片擴散法測定28 株II 型整合子陽性大腸桿菌分離株對9 大類18 種抗生素的藥敏性，質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922。按照CLSI（2019）推薦的標準判定分離株對該抗生素敏感（Susceptible，S）、中介（Intermediate，I）或耐藥（Resistance，R）[16]。18 種抗生素的藥敏片濃度及耐藥折點如表2所示。對3 類或以上抗生素耐藥的大腸桿菌記為多重耐藥菌。

表2 抗生素種類、藥敏片含量和耐藥折點Table 2 The category，concentration and breakpoint of the antibiotics used for Kirby-Bauer susceptibility test

1.2.5 II 型整合子適應性代價研究用大腸桿菌基因工程菌構建 適應性代價研究用質(zhì)粒pAKM 和大腸桿菌基因工程菌大腸桿菌MG1656 λatt∶∶gfp為本實驗室前期構建。質(zhì)粒pAKM 含p15a 低拷貝復制子、卡那霉素抗性基因和多克隆位點。菌株大腸桿菌MG1656 λatt∶∶gfp 在不引入適應性代價的λatt 位點插入組成型表達的gfp 基因，可穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白GFP。將質(zhì)粒pAKM 轉(zhuǎn)化至菌株大腸桿菌MG1656 λatt∶∶gfp，獲得適應性代價研究對照菌株LC。將II 型整合子與質(zhì)粒pAKM 連接，構建含典型II 型整合子基因盒的質(zhì)粒pAKMintI2*-3GC 和含非典型II 型整合子基因盒的質(zhì)粒pAKM-intI2*-4GC，將2 個質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至菌株大腸桿菌MG1656 λatt∶∶gfp，獲得試驗菌株LA1和LA2。

1.2.6 大腸桿菌基因工程菌最小抑菌濃度測定參照CLSI 推薦的微量營養(yǎng)肉湯稀釋法測定鏈霉素對照菌株LC 的最小抑菌濃度 （Minimal inhibitory concentration，MIC）[16]。

1.2.7 II 型整合子適應性代價分析 參照文獻[17]的方法，利用競爭試驗法分析II 型整合子的適應性代價。將試驗菌株LA1、LA2 與對照菌株LC 在LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，按1∶1（體積比）混合，每培養(yǎng)24 h 后以1∶100（體積比）接種至新鮮LB 液體培養(yǎng)基，連續(xù)轉(zhuǎn)接4 次，共培養(yǎng)5 d。競爭試驗混合液每轉(zhuǎn)接前取100 μL 樣品，通過BD AccuriC6 流式細胞儀測定混合液中含GFP 蛋白細胞數(shù)量和總細胞數(shù)量，從而獲得試驗菌株LA1 或LA2 相對于對照菌株LC 的相對頻數(shù)F（Fnon-GFP/FGFP）。

以競爭試驗中獲得的相對頻數(shù)自然對數(shù)lnF為因變量y，以時間（d）為自變量x，擬合線性回歸方程y=kx+b。試驗菌株相對于對照菌株的適應性代價選擇系數(shù)S=k/ln（1/t），t——稀釋倍數(shù)（1∶100）。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗做3 個重復。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和最小顯著差異法（Least significant difference）比較不同數(shù)據(jù)組間的差異。采用SPSS（Version 20.0）軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，P＜0.05 認為差異具有統(tǒng)計學意義。利用GraphPad Prism 8 作圖。

2 結果與分析

2.1 水產(chǎn)源大腸桿菌的分離鑒定

本研究采集了浙江省市售南美白對蝦、牡蠣和大黃魚樣品各200 份，預處理并培養(yǎng)后挑取具黑色中心有綠色金屬光澤的大腸桿菌疑似菌落（圖1a），以大腸桿菌特異基因uidA 為靶標進行PCR 鑒定（圖1b），共分離到278 株大腸桿菌，其中93 株來自南美白對蝦樣品，102 株來自牡蠣樣品，83 株來自大黃魚樣品，大腸桿菌總分離率為46.3%。據(jù)文獻報道，大腸桿菌因在水產(chǎn)品中宿主廣泛、易通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因，常成為耐藥基因的蓄積庫和傳播媒介，故大腸桿菌也被用作監(jiān)測環(huán)境中耐藥基因或元件的指示菌[18-19]。

圖1 大腸桿菌的選擇性分離與PCR 分子鑒定Fig.1 Selective isolation and PCR molecular identification of Escherichia coli

2.2 II 型整合子的分離鑒定及結構分析

278 株水產(chǎn)源大腸桿菌中，有28 株（10.1%）II型整合酶基因intI2 陽性（圖2a），其中27 個II 型整合子全長約3 200 bp （圖2b），1 個II 型整合子全長約4 000 bp（圖2c）。

圖2 II 型整合子的分離鑒定Fig.2 Isolation and identification of class II integrons

對28 個II 型整合子全長擴增片段進行回收測序和BLAST 比對分析，并結合文獻報道繪制出基本結構[5-6，20-21]。28 個II 型整合子的基本結構如圖3所示：（1）II 型整合酶基因intI2，編碼II 型整合酶；本研究分離到的28 個II 型整合子均含缺陷型整合酶，即intI2 在第178 位氨基酸后出現(xiàn)終止密碼子TAA，致使其無法表達出完整的具有催化活性的整合酶蛋白，故標為intI2*。（2）attI 重組位點，可特異性組合attC 重組位點，用以整合和捕獲基因盒。（3）Pc 啟動子，負責可變區(qū)內(nèi)基因盒轉(zhuǎn)錄表達；II 型整合子的Pc 啟動子有Pc2A，Pc2B，Pc2C 和Pc2D，共4 個。（4）Pint2啟動子負責整合酶轉(zhuǎn)錄表達，方向與Pc 的方向相反。（5）嵌有耐藥基因盒的可變區(qū)：27 個片段的耐藥基因盒陣列為dfrA1-sat2-aadA1，1 個片段的耐藥基因盒陣列為dfrA1-catB2-sat2-aadA1（分別為介導細菌對甲氧芐氨嘧啶耐藥的二氫葉酸還原酶基因dfrA1，介導細菌對鏈霉素耐藥的鏈絲菌素轉(zhuǎn)乙酰酶基因sat2，介導細菌對鏈霉素和大觀霉素耐藥的氨基糖苷類腺苷轉(zhuǎn)移酶基因aadA1 和介導細菌對氯霉素耐藥的乙?；D(zhuǎn)移酶基因catB2）。（6）3’CS 保守序列。

研究表明，流行最廣的典型II 型整合子包含缺陷型整合酶基因intI2* 與耐藥基因盒陣列dfrA1-sat2-aadA1（圖3A），該類II 型整合子雖有attI 和attC 重組位點，但因為整合酶的缺陷，導致其理論上僅能表達耐藥基因，不具備捕獲和剪切的功能[22]，因此，耐藥基因盒的陣列也相對固定。近年來，越來越多的新型II 型整合子基因盒陣列被發(fā)現(xiàn)，如本研究獲得的dfrA1-catB2-sat2-aadA1也曾在變形桿菌屬 （Proteus）、嗜水氣單胞菌屬（Aeromonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和希瓦氏菌屬（Shewanella）等菌中分離到的II 型整合子中發(fā)現(xiàn)過[23]，說明II型整合子仍然具有剪切捕獲耐藥基因和在不同細菌間傳播的功能，只是不依賴或不完全依賴II 型整合酶的作用[23]。此外，II 型整合子在自然界中沒有I 型整合子流行廣泛和耐藥基因盒多樣，然而仍具備重要的傳播耐藥基因的能力，其整合酶的特殊結構可能是為了維持功能進化與適應性代價間的平衡[13]。

圖3 II 型整合子結構圖Fig.3 Structure chart of class II integrons

2.3 II 型整合子陽性大腸桿菌的藥敏分析

對28 株II 型整合子陽性大腸桿菌分離株進行耐藥分析，發(fā)現(xiàn)均為多重耐藥菌，且共有17 種耐藥表型組合，耐藥模式多樣化（表3）。其中所有菌株都對甲氧芐氨嘧啶、鏈霉素和大觀霉素耐藥，可能與II 型整合子耐藥基因盒發(fā)揮相關作用有關。

表3 28 株II 型整合子陽性大腸桿菌分離株的耐藥譜Table 3 Drug resistance spectra of 28 class II integron positive Escherichia coli isolates

2.4 適應性代價分析

根據(jù)選擇系數(shù)S 值可判斷試驗菌株的適應性代價，若S＞0，說明菌株適應性良好；若S＜0，則菌株有適應性代價，且絕對值越大適應性代價越大[17]。如圖4所示，在無抗LB 培養(yǎng)條件下，試驗菌株LA1 和LA2 相對于對照菌株LC 的選擇系數(shù)S依次為-0.068±0.006 和-0.117±0.009，均小于0，表明攜帶II 型整合子的大腸桿菌在不含抗生素的環(huán)境下存在適應性代價。此外，試驗菌株LA2 比LA1 多1 個catB2 耐藥基因盒，生長速率又下降了4.9%，說明基因盒的數(shù)量和種類在一定程度上也影響整合子陽性菌株的適應性代價。據(jù)文獻報道，I 型整合子陽性的大腸桿菌工程菌選擇系數(shù)S在-0.013±0.002 至-0.04±0.003 之間，即大腸桿菌的生長速率下降在1.3%～4%之間，顯著低于II型整合子（P＜0.05），這可能也是環(huán)境中I 型整合子比II 型整合子數(shù)量多且基因盒類型豐富的主要原因之一。

圖4 II 型整合子陽性大腸桿菌基因工程菌在無抗和抗生素亞抑制濃度下的適應性代價選擇系數(shù)SFig.4 Fitness cost selection coefficient S of class II integron positive Escherichia coli genetically engineered bacteria in the absence of antibiotics and at subinhibitory concentrations of antibiotics

在亞抑制濃度試驗中，因本次分離到的II 型整合子基因盒以及試驗菌株LA1 和LA2 均含鏈霉素耐藥基因，而對照菌株LC 不含鏈霉素耐藥基因，故選擇鏈霉素作為亞抑制濃度下競爭試驗的代表抗生素。鏈霉素對對照菌株LC 的MIC 值為8 μg/mL，以40%MIC（3.2 μg/mL 鏈霉素）和20%MIC（1.6 μg/mL 鏈霉素）作為亞抑制濃度值。如圖4所示，在抗生素亞抑制濃度 （40%MIC 和20%MIC）下，2 類II 型整合子的選擇系數(shù)S 均大于0，適應性良好。在20%MIC 時，試驗菌株LA1 的S值為0.047 ± 0.005，LA2 的S 值為0.107 ± 0.010；在40%MIC 時，試驗菌株LA1 的S 值為0.138 ±0.003，LA2 的S 值為0.144±0.012。40%MIC 下的菌株適應性顯著好于20%MIC 下的適應性，且亞抑制濃度下菌株適應性顯著好于無抗條件下的菌株適應性（P＜0.05）。因此，環(huán)境中低濃度抗生素有利于II 型整合子在宿主菌中的維持和富集，從而促進其有效應對外界抗生素壓力以及在細菌間傳播擴散。

3 結論

采集浙江省市售南美白對蝦、牡蠣和大黃魚樣品各200 份，分離到大腸桿菌278 株，其中28株攜帶II 型整合子且均為多重耐藥菌株，耐藥模式多樣。對II 型整合子進行結構分析可得，整合酶均為缺陷型，其中27 個含典型耐藥基因盒dfrA1-sat2-aadA1，1 個含非典型基因盒 dfrA1-catB2-sat2-aadA1。此外，攜帶II 型整合子的大腸桿菌工程菌在抗生素亞抑制濃度下選擇系數(shù)S 均大于0，適應性良好，然而在無抗環(huán)境下均有明顯的適應性代價。綜上，II 型整合子在水產(chǎn)源大腸桿菌中已有一定比例，且低濃度抗生素有利于其維持和富集，從而促進其有效應對外界抗生素壓力以及在細菌間的傳播擴散。