王鵬俠，阮成江，杜 維，趙 振

(1.甘肅省渭源縣林業(yè)和草原服務(wù)中心，甘肅 渭源 748200；2.大連民族大學(xué) 資源植物研究所，遼寧 大連 116600；3.吳忠市協(xié)貴厚種植專業(yè)合作社，寧夏 吳忠 751100)

文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)是中國(guó)北方特有的木本油料樹種，廣泛分布于遼寧、內(nèi)蒙、寧夏、甘肅和新疆等地[1]。文冠果具有耐旱、耐鹽堿、耐寒和適應(yīng)沙地等抗逆特性，可以在土壤貧瘠和氣候干旱的地區(qū)種植[2]。文冠果種子含油率可達(dá)35%以上、種仁含油率可達(dá)67%以上，油脂中含有豐富的不飽和脂肪酸，如油酸、亞油酸和神經(jīng)酸等[3]。

植物種子發(fā)育受內(nèi)源激素的嚴(yán)格調(diào)控，如生長(zhǎng)素和赤霉素可促進(jìn)種子膨大、脫落酸可促進(jìn)糖酸形成等[4,5]。但生長(zhǎng)素(IAA)、細(xì)胞分裂素(CTK)、赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)在文冠果種子發(fā)育過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化仍不清楚。本文以不同發(fā)育期文冠果種仁為實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)固相萃取提取純化內(nèi)源激素，利用液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)分析不同發(fā)育期文冠果種仁內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)種子發(fā)育的影響，旨在為理解內(nèi)源激素對(duì)文冠果種子發(fā)育的調(diào)控規(guī)律提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

文冠果不同發(fā)育期種子分別于2019年采收自寧夏回族自治區(qū)吳忠市國(guó)家農(nóng)業(yè)科技示范園區(qū)文冠果基地。選取花后50天(50 days after flowering DAF 前期)、65天(65 DAF中期)、80天(80 DAF 末期)和95天(95 DAF成熟期)4個(gè)發(fā)育期，采收時(shí)選取發(fā)育良好的果實(shí)，取出種子混合后用錫紙包裹液氮速凍，干冰運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室以后，保存于-80 ℃冰箱中、備用。

1.2 種子含油率測(cè)定

選取50、65、80和95 DAF 4個(gè)發(fā)育期種子，剝種皮后對(duì)種仁進(jìn)行形態(tài)觀察并拍照。

采用氯仿甲醇法測(cè)定文冠果種仁含油率[6]。將烘干的文冠果種仁研磨，精確稱取0.3 g研磨后的種仁并轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，加入含有60%氯仿的甲醇溶液，劇烈震蕩1 min后于4 ℃冰箱中靜置過(guò)夜。過(guò)夜靜置后10 000g離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入300 μL 1% KCl溶液震蕩5 min，震蕩后10 000g離心5 min，棄上清液，將下層氯仿相轉(zhuǎn)移至重量已知的離心管中。風(fēng)干或真空濃縮氯仿相，稱重后與空管差值即為種仁的含油量。每個(gè)樣品做3次重復(fù)。

1.3 內(nèi)源激素提取純化與檢測(cè)方法建立

采用甲醇法結(jié)合固相萃取提取和純化種仁內(nèi)源激素[7]。將樣品從低溫冰箱取出，液氮研磨后稱重(1～2 g)轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入5 mL 體積比為75%甲醇、5%甲酸水溶液過(guò)夜提取。10 000g離心20 min, 加入2 mL提取液清洗沉淀2次，合并離心后的提取液，離心濃縮至溶液體積為3 mL，濃縮后用1 mol·L-1甲酸溶液定容至10 mL。MCX固相萃取柱對(duì)提取液進(jìn)行純化：用2 mL甲醇純化，2 mL 1%甲酸溶液平衡，進(jìn)樣后先用2 mL甲醇洗脫得到IAA、ABA和GA3，用3 mL氨化甲醇(含有0.35 mol·L-1氨水、60%甲醇的水溶液)洗脫得到CTK。合并洗脫液，用甲醇定容至10 mL。上樣前樣品經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾，由于植物內(nèi)源激素易見光分解，提取時(shí)應(yīng)用棕色容器避光操作。

采用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)純化后的內(nèi)源激素進(jìn)行測(cè)定[7]，液相條件為：A為1%甲酸溶液，B為甲醇溶液。洗脫程序：0～5 min 10% B，5～20 min 10%～90% B，20～25 min 90% B, 25.1～35 min 10% B。色譜柱為C18柱(150 mm×4.6 mm)，流速為1 mL·min-1，柱溫40 ℃。質(zhì)譜采用ESI離子源，離子化電壓為+5500 V，TEM：550℃，MRM模式下優(yōu)化IAA、GA3、ABA和CTK的檢測(cè)條件以增加離子信號(hào)強(qiáng)度，提高檢出限。4種植物內(nèi)源激素采用外標(biāo)法定量，樣品測(cè)定峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，計(jì)算對(duì)應(yīng)激素的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果種子發(fā)育過(guò)程形態(tài)學(xué)觀察

寧夏吳忠文冠果花期為5月上中旬，隨后進(jìn)入種子發(fā)育期。6月下旬至8月初為種子發(fā)育到成熟期圖1。50 DAF時(shí)，種皮白色、種仁綠色，種子硬度較低，含水量較高；65 DAF，種皮由白色變?yōu)辄S棕色，種仁變大的同時(shí)葉綠素逐漸降解，種子含水量不斷下降，硬度有所提高；80 DAF，種皮逐漸脫水木質(zhì)化，顏色由黃棕色變?yōu)樽厣?，種仁體積進(jìn)一步增大，顏色逐漸變淺；95 DAF果實(shí)成熟時(shí)，種子顏色變?yōu)楹谏?，硬度較高，種仁葉綠素完全降解，顏色變?yōu)榘咨?/p>

(注：左至右時(shí)期分別為：50、65、80和95 DAF)

2.2 文冠果不同發(fā)育期種子含油率變化

文冠果種子含油率隨發(fā)育進(jìn)程迅速升高，文冠果不同發(fā)育期種子含油率變化如圖2。50 DAF種子含油率僅為7.13%，50～65 DAF為種子油脂快速合成積累期，含油率由7.31%快速升高到31.47%，增長(zhǎng)率為341%。65 DAF后種子油脂合成積累速率減慢，到95 DAF上升到41.1%。由此可見，50～65 DAF為文冠果種子油脂合成積累的關(guān)鍵時(shí)期，種子發(fā)育中后期的油脂積累對(duì)總油脂含量貢獻(xiàn)相對(duì)較小。

圖2 文冠果不同發(fā)育期種子含油率變化

2.3 內(nèi)源激素提取純化與檢測(cè)方法建立

對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表1。IAA和CTK為正離子掃描模式，定量子離子荷質(zhì)比(m/z)分別為130.2和136.3。ABA和GA3為負(fù)離子掃描模式，定量子離子分別為153.1和239.2。調(diào)整每種內(nèi)源激素的碰撞能量和去簇電壓以得到最高響應(yīng)值，內(nèi)源激素GA3在負(fù)離子模式下母離子345.1只能產(chǎn)生1種對(duì)應(yīng)的子離子。對(duì)濃度范圍10～500 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測(cè)定，得到4種內(nèi)源激素標(biāo)準(zhǔn)品峰面積和對(duì)應(yīng)濃度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99，符合外標(biāo)法定量要求。

表1 4種內(nèi)源激素MRM參數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

4種內(nèi)源激素50 ng·mL-1的LC-MS/MS圖如圖3。內(nèi)源激素根據(jù)非極性由弱至強(qiáng)，出峰時(shí)間依次為CTK 4.5 min、ABA 13.8 min、GA318.1 min和IAA 24.1 min。無(wú)雜峰且峰型對(duì)稱，無(wú)明顯前沿和拖尾現(xiàn)象。由于試驗(yàn)采用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)進(jìn)行信號(hào)采集，避免了單獨(dú)使用高效液相色譜法時(shí)植物細(xì)胞內(nèi)色素、黃酮和多酚等非極性生物活性物質(zhì)對(duì)目標(biāo)出峰產(chǎn)生的干擾。

圖3 4種內(nèi)源激素LC-MS/MS圖

2.4 文冠果種子發(fā)育過(guò)程內(nèi)源激素變化

文冠果種子發(fā)育過(guò)程中，不同種類內(nèi)源激素含量變化規(guī)律存在明顯差異，動(dòng)態(tài)變化如圖4。IAA含量在種子發(fā)育前中期保持穩(wěn)定(0.90 nmol·L-1)，發(fā)育末期略有下降(0.63 nmol·L-1)，但種子成熟時(shí)IAA含量急劇上升，是發(fā)育前中期的1.78倍，達(dá)到1.6 nmol·L-1。說(shuō)明種子發(fā)育后期IAA含量升高可能利于促進(jìn)種子脫水成熟及休眠，與Liu的研究結(jié)果一致[8]。

GA3含量隨文冠果種子發(fā)育進(jìn)程呈下降趨勢(shì)，50、65 DAF濃度分別為0.19 nmol·L-1和0.13 nmol·L-1，發(fā)育末期和成熟期穩(wěn)定在0.038 nmol·L-1和0.026 nmol·L-1。GA3與植物細(xì)胞代謝速率相關(guān)[9]，GA3含量降低反映出文冠果種子發(fā)育過(guò)程細(xì)胞代謝逐漸減緩，直至成熟時(shí)降至較低水平。成熟后隨著脫水的進(jìn)行，種子逐漸進(jìn)入休眠，代謝速率降至最低。這與GA3作為細(xì)胞代謝強(qiáng)度的指標(biāo)反映著植物細(xì)胞活性[10]的結(jié)果相一致。

在不同發(fā)育期文冠果種子中，ABA濃度最高時(shí)較其他三種激素最高濃度高8～50倍左右如圖4。在不同發(fā)育期種子中，ABA濃度隨種子發(fā)育進(jìn)程而呈明顯下降趨勢(shì)。種子發(fā)育前期(30 DAF)，ABA濃度高達(dá)10.79 nmol·L-1，中后期逐漸降低，成熟期降至最低點(diǎn)(0.78 nmol·L-1)。ABA在調(diào)控種子發(fā)育成熟和產(chǎn)物合成積累等方面起到重要的調(diào)控作用，高濃度的ABA可以促進(jìn)碳水化合物和脂類的合成與積累[11]。文冠果種子含油率在發(fā)育前中期增速較快可能與ABA濃度較高相關(guān)，前中期高水平的ABA對(duì)應(yīng)文冠果種子油脂的快速合成積累。

a) IAA b)GA3

CTK在文冠果種子發(fā)育前中期維持較高水平(0.38 nmol·L-1、0.51 nmol·L-1)，但后期和成熟期逐漸降至較低水平(0.13 nmol·L-1、0.02 nmol·L-1)。前中期高水平的CTK可促進(jìn)文冠果種仁細(xì)胞分裂，使種仁體積在前中期有較快幅度的增大，這與CTK可促進(jìn)細(xì)胞分裂、分化[12]的結(jié)果相一致。

3 結(jié) 語(yǔ)

文冠果種子含油率隨發(fā)育進(jìn)程逐漸升高，前中期是種子油脂形成的關(guān)鍵時(shí)期。不同發(fā)育期文冠果種子不同內(nèi)源激素動(dòng)態(tài)變化的差異明顯，IAA在果實(shí)成熟時(shí)含量最高，可促進(jìn)種子脫水成熟；GA3隨果實(shí)發(fā)育過(guò)程含量逐漸降低，與種子細(xì)胞活性一致；ABA濃度與含油率增長(zhǎng)速率成正相關(guān)，高濃度ABA有助于文冠果種子油脂的快速積累；種子發(fā)育前期CTK含量較高，可促進(jìn)文冠果種仁體積的增大。

植物種子發(fā)育的激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，內(nèi)源激素、轉(zhuǎn)錄因子以及相關(guān)信號(hào)分子一起控制這一復(fù)雜過(guò)程。文冠果種子內(nèi)源激素動(dòng)態(tài)變化的研究有助于從激素水平揭示文冠果種子生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，也可為制定提高種子含油量的調(diào)控措施提供科學(xué)參考。