□ 郜鑫洋 陳樹興

（河南科技大學(xué)，河南 洛陽(yáng) 471000）

秀麗隱桿線蟲是一種常見的模式生物，壽命為14～21天。擁有1萬(wàn)個(gè)堿基，1.78萬(wàn)個(gè)不同基因，959個(gè)體細(xì)胞和300個(gè)神經(jīng)元，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、世代周期短并且易于繁殖，是生物科學(xué)研究中應(yīng)用最普遍的模式生物［1-3］。而雙歧桿菌是一種普遍存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的益生菌，它們能夠產(chǎn)生具有多種生物功能的胞外多糖，并且已經(jīng)能夠被提取、分離和純化，并進(jìn)行其各種特性的研究。由于秀麗隱桿線蟲是十分常用的模式生物被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、毒理學(xué)乃至植物寄生線蟲等方面（秀麗隱桿線蟲擁有許多和植物寄生線蟲相似的特征），所以研究其較簡(jiǎn)便且能長(zhǎng)期保存的方法，具有現(xiàn)實(shí)意義。同時(shí)，雙歧桿菌胞外多糖已被證明擁有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等功能。如果能夠證明雙歧桿菌胞外多糖能夠提高生物的低溫抗性，那么對(duì)開發(fā)新的冷凍保護(hù)液很有幫助，對(duì)雙歧桿菌及產(chǎn)物的研究也具有重要意義。

一、實(shí)驗(yàn)與方法

（一）材料

供試線蟲品系為本實(shí)驗(yàn)室保藏的N2野生型秀麗隱桿線蟲，購(gòu)買自省內(nèi)實(shí)驗(yàn)室。其保存條件為：-80℃超低溫冰箱中冷凍保存。

雙歧桿菌：供試雙歧桿菌為RH型動(dòng)物雙歧桿菌，來(lái)自百歲老人的腸道，由本實(shí)驗(yàn)室人員分離、培養(yǎng)并保存。保藏方式為：-20℃低溫冰箱冷凍保存。

大腸桿菌：供試大腸桿菌為OP50尿嘧啶突變型，為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。保存方式為：-20℃低溫冷凍保存。

LB培養(yǎng)基：1g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、0.5gNaCl（固體培養(yǎng)基需要加入1.7g瓊脂粉），加水定容至100ml，溶解后高壓滅菌（115℃，15min），冷卻后放入4℃冰箱中備用。

NGM培養(yǎng)基：取0.3gNaCl、1.7g瓊脂、0.25g蛋白胨、2.5mlPBS緩沖液，加水定容至100ml后高壓滅菌（115℃，15min），待培養(yǎng)液降溫至60℃后再加入膽固醇乙醇溶液O.1mL（5mg/mL）、MgS04 0.1mL（1mol/L）、CaCl2 0.1mL（1mol/L）。然后迅速搖勻并倒平板制得NGM固體培養(yǎng)基，4℃冰箱冷藏備用。

脫脂乳培養(yǎng)基：脫脂乳粉120g、1000mL蒸餾水充氮?dú)猓?05℃滅菌10min。

雙歧桿菌酶解液：中性蛋白酶、胰蛋白酶質(zhì)量比為1∶2混合酶2g，加入蒸餾水1000ml（注意：酶解液要現(xiàn)配現(xiàn)用）。

秀麗隱桿線蟲裂解液：NaOH0.6g、10%NaCl溶液100μl、無(wú)菌水49.9ml。

冷凍保護(hù)液：M9緩沖液、甘油體積比為7∶3，之后根據(jù)需要加入雙歧桿菌多糖溶液。加入后混勻。注意，此保護(hù)液現(xiàn)配現(xiàn)用。

（二）方法

1.秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)

大腸桿菌OP50的培養(yǎng)：取1g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、0.5g氯化鈉、1.7g瓊脂粉，加水定容至100ml配制成LB固體培養(yǎng)基，高壓滅菌后倒平板，待平板凝固后，使用接種取大腸桿菌OP50菌種液進(jìn)行劃線培養(yǎng)（注意：每劃一次線，都有將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒，待冷卻后再劃，重復(fù)3次），劃線后，將培養(yǎng)皿放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

大腸桿菌OP50懸液的制備：配制LB液體培養(yǎng)基：取1g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、0.5g氯化鈉加水定容至100ml后高壓滅菌，冷卻后取出劃線培養(yǎng)基在超凈工作臺(tái)中使用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落放入LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24h。之后，將菌液放入4℃冰箱中冷藏備用。

秀麗隱桿線蟲蟲體的培養(yǎng)：取凍存的秀麗隱桿線蟲樣本，在37℃水浴中解凍復(fù)蘇后接種到涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，注意擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)方法是：每天取數(shù)只雌雄同體產(chǎn)卵期秀麗隱桿線蟲，用顯微鉤針轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)數(shù)代后進(jìn)行同步化處理，為接下來(lái)的冷凍保存實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

同步化處理（又稱同期化培養(yǎng)）：使用M9緩沖液沖洗培養(yǎng)基上的線蟲，沖洗完畢后，轉(zhuǎn)移到錐形瓶中靜置20min，之后加入裂解液，震蕩裂解15min后，分裝入4ml離心管。2517g離心1min后，沉淀用4ml緩沖液懸浮后離心，沉淀再加入無(wú)菌水懸浮后離心重復(fù)3次，之后在沉淀中加入1ml無(wú)菌水，放入NGM培養(yǎng)基中22℃培養(yǎng)7d。注意，第二次培養(yǎng)時(shí)涂布的菌液要少一些，以便于獲得dauer期幼蟲。［4］因?yàn)閐auer期幼蟲擁有更強(qiáng)的抗逆性。

2.RH雙歧桿菌胞外多糖EPS的制備分離和純化［5］

產(chǎn)糖發(fā)酵：菌種在脫脂乳培養(yǎng)基中活化3代，取對(duì)數(shù)末期培養(yǎng)液接種至新鮮無(wú)菌脫脂乳培養(yǎng)基，接種量為107CFU／mL，于37℃厭氧發(fā)酵60 h得到發(fā)酵液。

酶解：將雙歧桿菌發(fā)酵液用4層醫(yī)用紗布過(guò)濾，除去酸沉酪蛋白塊。過(guò)濾液100℃加熱5min，8000 r／min離心10 min后取上清液。冷卻后，將上清液pH調(diào)節(jié)至7.5，之后加入2g/ml酶解液酶解120min。

分離，提取與純化：將酶解液在沸水浴中滅酶5min，待酶解液冷卻后8000 r／min離心10min；上清液中加入3倍體積無(wú)水乙醇，4℃沉淀過(guò)夜，沉淀用少量蒸餾水復(fù)溶，8 000～12000D透析袋4℃透析48h，真空冷凍干燥后獲得EPS粗品，粗品需避光干燥保存。

將分離、提取獲得的EPS粗品配制成5mg/ml糖液。45 μm水系濾膜過(guò)濾后進(jìn)行Sepharose CL.6B凝膠柱層析，上樣量為4ml用0.05mol／lNaCl恒速洗脫，洗脫速率為0.8mL／min，每管8mL部分收集，并使用硫酸-苯酚測(cè)定A480mm法［7］逐管檢測(cè)多糖含量，按多糖含量檢測(cè)值收集峰值管，8000～12000D透析袋透析并冷凍干燥，獲得成品。

3.線蟲冷凍實(shí)驗(yàn)

秀麗隱桿線蟲的保藏實(shí)驗(yàn)共設(shè)三個(gè)因子：（1）冷凍保藏時(shí)間2個(gè)水平；（2）雙歧桿菌多糖用量3個(gè)水平；（3）冷凍保藏溫度2個(gè)水平，完全實(shí)驗(yàn)共構(gòu)成2×3×2=12個(gè)水平（表1），每個(gè)處理重復(fù)3次。處理時(shí)取約500頭秀麗隱桿線蟲置于4ml的Eppendorf離心管中，加入含有不同濃度雙歧桿菌的保藏液。封口膠密封后置于-20℃和-80℃的低溫冰箱中保存60d或120d。水浴解凍后取100μl鏡檢線蟲存活情況，剩下的接種于NGM培養(yǎng)基上于22℃下培養(yǎng)7d。死亡判定：向線蟲液中滴入一滴5%氯化鈉溶液并鏡檢，如果顯微鏡下蟲體僵直不動(dòng)，則視為死亡。

表1 冷凍保藏實(shí)驗(yàn)的分組設(shè)置

（三）統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS26統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)線蟲死亡率進(jìn)行方差分析。各因子差異采用正交變換分解平方和。對(duì)線蟲死亡率數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素方差分析。采用Duncan’S 多重極差檢驗(yàn)法對(duì)24個(gè)處理間差異進(jìn)行簡(jiǎn)單的多重比較。

二、結(jié)果與分析

（一）雙歧桿菌多糖用量對(duì)秀麗隱桿線蟲存活率影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙歧桿菌多糖用量對(duì)秀麗隱桿線蟲存活率有顯著的影響。不添加雙歧桿菌多糖的保護(hù)液保藏的秀麗隱桿線蟲的平均存活率為2.31%；雙歧桿菌多糖用量為20g/l時(shí)平均存活率為14.31%；而雙歧桿菌多糖用量為40g/l時(shí)，平均存活率達(dá)到了23.40%。

（二）冷凍保藏時(shí)間對(duì)秀麗隱桿線蟲存活率的影響

保藏時(shí)間會(huì)對(duì)秀麗隱桿線蟲的存活率有顯著的影響。線蟲存活率會(huì)隨著保藏時(shí)間延長(zhǎng)而降低。保藏60d和120d的平均存活率分別為14.78%和12.73%。最高存活率分別為43.22%和40.90%。

12個(gè)條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)保藏時(shí)間影響最大的因素是雙歧桿菌多糖的用量，其次是保藏時(shí)間。保藏溫度為-80℃且保藏時(shí)間為120d的情況下，存活率均大于40%，并且與其他組差異顯著，接種到NGM培養(yǎng)基上可以看到大量線蟲。因此建議采用處理編號(hào)為12（-80℃，多糖用量40g/l，保存120d；雖然存活率最高但是保存時(shí)間短）。如圖1～3所示。

圖1 冷凍時(shí)間對(duì)存活率的影響

圖2 雙歧桿菌多糖用量對(duì)存活率的影響

圖3 12個(gè)處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

三、結(jié)語(yǔ)

前人研究了在不同溫度下向多種溶液（水、PBS緩沖液、M9緩沖液等，本實(shí)驗(yàn)使用的是M9緩沖液）中加入如DMSO、甘油（本實(shí)驗(yàn)使用）等物質(zhì)來(lái)保藏秀麗隱桿線蟲的效果，但是很少有人設(shè)想雙歧桿菌胞外多糖也可能具有類似的功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RH雙歧桿菌胞外多糖確實(shí)具有類似的功能，而且對(duì)秀麗隱桿線蟲保藏具有決定性作用。當(dāng)冷凍保藏溫度為-80℃，雙歧桿菌多糖用量為40g/l時(shí)，就能有效保藏秀麗隱桿線蟲120d。

四、回首歷史，展望未來(lái)

1949年，Polae等人發(fā)現(xiàn)了甘油具有保護(hù)細(xì)胞的作用。1988年，Sulston和他的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)放置于10%甘油溶液中的秀麗隱桿線蟲蟲體可以在低溫下保存25年以上。我國(guó)李有全［8-10］等人在秀麗隱桿線蟲冷凍保存方面的研究也取得了很大的突破。周紅也在前人的研究成果的基礎(chǔ)上通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步討論并分析了影響線蟲冷凍保存的決定性因素。而在2016年，武文浩［4］建立了秀麗隱桿線蟲的冷凍保藏方法，并確立了最佳的冷凍條件。但是以上研究仍然存在各自的局限性。

細(xì)胞在低溫下能保存更長(zhǎng)時(shí)間是因?yàn)樵诘蜏叵录?xì)胞的生化反應(yīng)速度會(huì)減慢，因此代謝速度降低。而代謝速度的降低又可以減少垃圾物質(zhì)的排放，然后減少細(xì)胞的凋亡和死亡，減輕器官的缺血再灌注損傷等。而且酶在低溫下的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易失活。但是低溫對(duì)細(xì)胞和生物體可能造成的損害是多方面的。主要表現(xiàn)在冰晶損傷、溶液滲透損傷、過(guò)冷休克、結(jié)構(gòu)水的破壞、電解質(zhì)失衡，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞DNA的破壞［11-13］，于是需要設(shè)法減輕低溫帶來(lái)的負(fù)面影響。

冷凍保護(hù)劑的出現(xiàn)與發(fā)展使得如何減輕低溫對(duì)細(xì)胞損害這個(gè)問(wèn)題有了很大的突破，冷凍保護(hù)液能夠最大限度地減輕低溫對(duì)細(xì)胞的損傷。目前常用的冷凍保護(hù)劑有甘油、甲醇、DMSO（二甲基亞砜）等，但是這些物質(zhì)可能會(huì)對(duì)細(xì)胞和生物體帶來(lái)其他負(fù)面影響，甚至具有毒性（DMSO），因此需要改良。

雙歧桿菌（Bifidobacterium）屬是一種革蘭氏陽(yáng)性的、不運(yùn)動(dòng)的、細(xì)胞呈桿狀的、一段有時(shí)呈分叉狀的嚴(yán)格厭氧菌屬，它們廣泛存在于人體的消化道等部位，是非常有用的益生菌。它們?cè)谌梭w內(nèi)有合成維生素，抑制有害菌等功能，也能產(chǎn)生乙酸、丙酸、乳酸等有機(jī)物促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，并凈化腸道環(huán)境。雙歧桿菌還可以產(chǎn)生胞外多糖，EPS有中性和酸性兩種，EPS能夠抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)動(dòng)物的腸道菌群和免疫，甚至還可以清除毒素［14-15］。但是，目前對(duì)EPS 的研究仍然停留在EPS的生產(chǎn)、提取與純化［16］，以及EPS的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)［17］和EPS活性產(chǎn)品的研制等方面［18-20］。盡管甘敏［21］在李勝杰［22-25］等人提供的一些理論基礎(chǔ)上通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)EPS的益生作用及其機(jī)理進(jìn)行了一些探究，但是雙歧桿菌EPS的功能以及其作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的探索。

展望未來(lái)，本課題確認(rèn)了RH雙歧桿菌胞外多糖確實(shí)具有延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲冷凍保藏時(shí)間的能力，未來(lái)可以對(duì)雙歧桿菌胞外多糖延長(zhǎng)生物冷凍保藏能力的原因以及作用機(jī)制做更深入的研究，進(jìn)一步了解雙歧桿菌多糖的功能及其機(jī)理。