楊博宇，蔡 毅，孫魯寧，欒澤東，龐文艷，吳秀山，范雄偉，江志鋼*

（1. 湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育研究中心，長(zhǎng)沙 410081；2. 萊州市婦幼保健院，煙臺(tái) 261400）

福爾馬林（4%甲醛）浸泡是一種常見的保存組織樣本的方式，其固定的人類組織樣本通常是分子遺傳學(xué)研究的一種極其寶貴的資源［1-2］，通常是可供個(gè)體基因測(cè)序的唯一樣本。福爾馬林可固定保留組織和細(xì)胞的形態(tài)以供解剖病理學(xué)家評(píng)估，它還使固定的組織能夠在常溫條件下儲(chǔ)存。然而，使用福爾馬林浸泡的組織其DNA在進(jìn)行分子檢測(cè)時(shí)通常存在問題。由于序列的隨機(jī)斷裂，從福爾馬林保存的組織中提取的基因組DNA被高度降解，導(dǎo)致可用于PCR擴(kuò)增的可擴(kuò)增模板的數(shù)量顯著減少［3-4］。由于DNA降解，這種類型的組織中只能擴(kuò)增出短序列，通常少于100個(gè)堿基。過去經(jīng)常使用非緩沖甲醛溶液保存樣本，在保存了20年以上的組織中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)更廣泛的核酸降解。沒有緩沖的甲醛溶液會(huì)被氧化成甲酸，而酸性環(huán)境是DNA降解的主要原因。DNA在輕度酸性溶液中相對(duì)穩(wěn)定，但在pH值為4左右時(shí)，嘌呤堿基中的β糖苷鍵被水解，最終導(dǎo)致DNA片段的斷裂［5］。除此之外，甲醛浸泡的組織樣本通常存在DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)的復(fù)合物，可阻礙蛋白酶對(duì)組織的消化, 從而影響DNA的提取。同時(shí)，在PCR擴(kuò)增時(shí)，復(fù)合物也會(huì)阻礙引物與模板的結(jié)合以及DNA雙鏈的延伸［6］。然而，為臨床診斷、基因測(cè)序、分子試驗(yàn)研究準(zhǔn)備足量的高質(zhì)量DNA是非常重要的［7-8］。本文擬從DNA提取的質(zhì)量濃度、純度以及體外擴(kuò)增效果三方面來探究甲醛浸泡組織的基因組DNA提取方法的實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所需的組織樣本為2019年6月、2019年10月、2021年1月和2021年7月使用福爾馬林浸泡的1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)引產(chǎn)人類胎兒的部分皮膚和肌肉組織，并于常溫儲(chǔ)存至今。試驗(yàn)開展時(shí)，其分別已在福爾馬林中固定約30、24、11、5個(gè)月。經(jīng)湖南師范大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審查，該研究的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和方案充分考慮了安全性和公平性原則，試驗(yàn)材料獲取方式正規(guī)、合法。研究?jī)?nèi)容和研究結(jié)果不存在利益沖突。

1.2 引物

本研究使用的引物為擎科生物（Tsingke）公司合成的通用引物。其序列為目的片段長(zhǎng)為175 bp的GATA4基因組引物（F：TGGAGACTTTGCAGTCGCTT；R: CTCAGATCCCGCTGCGTTTA）、目的片段長(zhǎng)為327 bp的GAPDH基因組引物（F：GGCTCTTAAAAAGTGCAGGGTC；R：ATGGTACATGACAAGGTGCGG）、目的片段長(zhǎng)為674 bp的LRRC10基因組引物（F：CCTGGCTTTTCTAGGGTCGG；R：CGCTGGACAAGATGGTGGAT）。

1.3 試劑盒

FastPure FFPE DNA Isolation Kit（Vazyme DC105）、Universal Genomic DNA Kit（康為世紀(jì) CW2298S）用于基因組DNA提取。2×Taq plus Master Mix（Biosharp，BL547B）用于PCR反應(yīng)。

1.4 方法

1.4.1 基于常規(guī)柱式DNA提取試劑盒的提取方法（提取方法一）

使用清洗消毒后的鑷子將甲醛中的組織塊取出，用眼科剪將約40 mg的組織盡量剪碎，放于吸水紙上吸干，并收集組織碎片放入滅菌EP管中。使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）浸泡2 h以洗去組織表面殘留的甲醛。將樣品以12000 r/min的速度離心5 min，吸棄上清液，加入U(xiǎn)niversal Genomic DNA Kit中的Buffer GTL（180 μL）和Proteinase K（20 μL），56℃水浴3 h。接下來的處理完全按照Universal Genomic DNA Kit的說明書操作。

1.4.2 經(jīng)改良的專門用于甲醛溶液浸泡組織的提取方法（提取方法二）

通過與1.4.1中相同的操作得到40 mg的組織碎片，放入滅菌EP管中。根據(jù)張紅玲等［9］的方法，使用核酸提取緩沖液（1.21 g/L Tris，5.84 g/L NaCl，0.37 g/L EDTA）和100%乙醇分別浸泡樣品，每次2 h，之后用核酸提取緩沖液沖洗2次。將樣品以12000 r/min的速度離心5 min，吸棄上清液，加入FastPure FFPE DNA Isolation Kit中的Buffer FTL（270 μL）和Proteinase K工作液（30 μL），振蕩約30 s。56℃水浴過夜（約12～16 h）。將樣品轉(zhuǎn)移至90℃水浴約1.5 h后，10000×g離心3 min，吸上清轉(zhuǎn)移至新EP管中并加入300 μL Buffer FL和300 μL無水乙醇，震蕩約30 s。將試劑盒內(nèi)置DNA吸附柱置于收集管中，轉(zhuǎn)移混合液至吸附柱中，10000×g離心60 s。棄濾液，將吸附柱置于收集管中，加入500 μLBuffer FW1（已加入乙醇）至吸附柱上，10000×g離心60 s。棄濾液，將吸附柱置于收集管中，加入650 μL Buffer FW2（已加入乙醇）至吸附柱上，10000×g離心60 s。棄濾液，將吸附柱置于收集管中，10000×g離心空柱3 min。將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，放置于37℃恒溫箱中5 min以揮發(fā)乙醇，分兩次共加入40 μL ddH2O至吸附柱膜中央，分別在室溫靜置1 min后以12000 r/min的速度離心2 min，以得到樣本的基因組DNA溶液。

1.4.3 基因組DNA的質(zhì)量濃度和純度檢測(cè)

加入99 μL ddH2O和1 μL DNA樣本，使用分光光度計(jì)（eppendorf BioPhotometer plus 6132）進(jìn)行dsDNA檢測(cè)，并記錄5次的質(zhì)量濃度，計(jì)算OD260nm/OD280nm、OD260nm/OD230nm的數(shù)值以求平均值。

1.4.4 基因組DNA的PCR擴(kuò)增

以所提取的甲醛浸泡組織的基因組DNA為模板，使用Thermo Fisher Scientific公司的PCR儀（Applied Biosystems MiniAmp A37028）擴(kuò)增人類基因序列。將PCR儀設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)門ouch Down降落PCR程序，具體如下：95℃ 預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸1 min；之后每個(gè)循環(huán)依次降低退火溫度1℃，直到56℃，共10個(gè)循環(huán)；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，23個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸3 min后，置于4℃存放。

1.4.5 瓊脂糖凝膠電泳

取適量DNA溶液，使用1.5%的瓊脂糖凝膠在150 V電壓下進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下檢測(cè)拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本基因組DNA提取及質(zhì)量濃度與純度測(cè)定

使用上述方法，分別將使用福爾馬林固定30個(gè)月的1號(hào)樣本、固定24個(gè)月的2號(hào)樣本、固定11個(gè)月的3號(hào)樣本和固定5個(gè)月的4號(hào)樣本剪碎，并分別提取其基因組DNA。各取1 μL，使用分光光度計(jì)測(cè)量其雙鏈DNA的質(zhì)量濃度，并計(jì)算OD260nm/OD280nm、OD260nm/OD230nm。表1和表2分別展示出使用提取方法一和提取方法二所得的基因組DNA溶液的檢測(cè)數(shù)值。結(jié)果顯示，同樣的樣本，使用改良的提取方法二提取的基因組DNA的質(zhì)量濃度普遍高于提取方法一，大部分的純度高于提取方法一。

表1 分光光度計(jì)測(cè)量提取方法一所得基因組的數(shù)值Tab. 1 Spectrophotometry was used to measure the value of the genome obtained by extraction method 1

表2 分光光度計(jì)測(cè)量提取方法二所得基因組的數(shù)值Tab. 2 Spectrophotometry was used to measure the value of the genome obtained by extraction method 2

2.2 樣本基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳

為了直觀地了解上述8份基因組DNA的提取效果，我們每份樣本取1 μL（方法二提取的4號(hào)樣本由于質(zhì)量濃度較高，取0.5 μL），混入適量的DNA Loading Buffer進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，所有樣本均有因甲醛長(zhǎng)期保存導(dǎo)致的降解的Smear DNA帶，這預(yù)示著基因組DNA提取成功，其中用改良的提取方法二得到的保存時(shí)間最短的4號(hào)樣品的DNA 的亮度最高（圖1）。

圖1 基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNAMethod 1：使用提取方法一得到的基因組；Method 2：使用提取方法二得到的基因組；M：DNA marker；1：使用固定30個(gè)月的1號(hào)樣本所提取的基因組DNA；2：使用固定24個(gè)月的2號(hào)樣本所提取的基因組DNA；3：使用固定11個(gè)月的3號(hào)樣本所提取的基因組DNA；4：使用固定5個(gè)月的4號(hào)樣本所提取的基因組DNA。Method 1: Genome obtained by extraction method 1; Method 2: Genome obtained by extraction method 2; M: DNA marker; 1: Genomic DNA extracted from No. 1 sample fixed for 30 months; 2: Genomic DNA extracted from No. 2 sample fixed for 24 months; 3: Genomic DNA extracted from No. 3 sample fixed for 11 months; 4: Genomic DNA extracted from No. 4 sample fixed for 5 months.

2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

由于基因組DNA的后續(xù)使用大多依賴于PCR體外擴(kuò)增，我們分別使用上述的8份基因組DNA各0.3 μL為模板，分別對(duì)來自人類GATA4、GAPDH、LRRC10三個(gè)基因，長(zhǎng)度為175、327、674 bp的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并分別取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示：兩種方法所提取的所有DNA模板均能擴(kuò)增出175 bp的GATA4基因片段；方法一所提取的4號(hào)DNA模板可以擴(kuò)增出327 bp的GAPDH基因片段，而方法二所提取的4號(hào)DNA模板可以擴(kuò)增出327 bp的GAPDH片段和674 bp的LRRC10基因片段，且產(chǎn)物質(zhì)量濃度較高（圖2）。這一結(jié)果證明，采用改良的專門用于甲醛溶液浸泡組織的基因組DNA提取方法提取出的基因組DNA的質(zhì)量要明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

圖2 以基因組 DNA 作為模板的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR products using genomic DNA as template每種PCR產(chǎn)物取5 μL點(diǎn)樣。M：DNA Marker；Method 1：以提取方法一得到的基因組為模板的PCR產(chǎn)物；Method 2：以提取方法二得到的基因組為模板的PCR產(chǎn)物；1：1號(hào)樣本基因組 DNA 為模板的 PCR 產(chǎn)物；2：2號(hào)樣本基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物；3：3號(hào)樣本基因組 DNA 為模板的 PCR 產(chǎn)物；4：4號(hào)樣本基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物；G：目的條帶為175 bp的GATA4片段產(chǎn)物；H：目的條帶為327 bp的GAPDH片段產(chǎn)物；L：目的條帶為674 bp的LRRC10片段產(chǎn)物。白色箭頭所指為目的條帶。5 μL samples were taken for each PCR product. M: DNA Marker; Method 1: PCR product using the genome obtained by extraction method 1 as template; Method 2: PCR products using the genome obtained by extraction method 2 as template; 1: PCR product of sample No. 1 genomic DNA as template; 2: PCR product of sample No. 2 genomic DNA as template; 3: PCR product of sample No. 3 genomic DNA as template; 4: PCR product of sample No. 4 genomic DNA as template product; G: The product of GATA4 fragment with 175 bp target band; H: The product of GPADH fragment with 327 bp target band; L: The product of LRRC10 fragment with 674 bp target band. The white arrow points to the target strip.

3 討論

根據(jù)前人的研究，固定時(shí)間是影響福爾馬林固定組織中DNA保存的主要因素［10］。我們的研究表明，隨著福爾馬林浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，一定質(zhì)量的組織中能夠提取出的基因組DNA量出現(xiàn)明顯的下降，這預(yù)示著對(duì)于福爾馬林固定的樣本的基因組DNA的提取和使用要盡早進(jìn)行。經(jīng)過嘗試，使用核酸提取緩沖液和乙醇沖洗的方法清洗福爾馬林浸泡樣本中的甲醛，并使用蛋白酶K長(zhǎng)時(shí)間消化，同時(shí)結(jié)合FFPE樣本基因組提取試劑盒，可有效地從最長(zhǎng)固定30個(gè)月的組織樣本中提取出一定量的基因組DNA，且PCR體外擴(kuò)增最高可擴(kuò)增出長(zhǎng)達(dá)674 bp的基因片段。與之相比，使用通用式的柱式基因組DNA提取試劑盒提取的1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)的基因組DNA溶液的質(zhì)量濃度均要低于改良方法，且2號(hào)樣品和3號(hào)樣品的OD260nm/OD280nm的數(shù)值明顯低于改良方法，更加偏離純凈的基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)值（1.80）。這預(yù)示著這種通用提取試劑盒的提取產(chǎn)物存在更嚴(yán)重的蛋白質(zhì)污染［11-13］，而這很可能是甲醛浸泡導(dǎo)致的蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)造成的。除此之外，四種樣品使用通用式基因組DNA提取試劑盒所得DNA的OD260nm/OD230nm的數(shù)值均小于我們的改進(jìn)方法，而此值明顯偏小時(shí)表明樣品可能被糖類、鹽類或有機(jī)溶劑污染［14］。以上結(jié)果證明，我們改進(jìn)的基因組提取方法是有效且實(shí)用的，其PCR擴(kuò)增效率明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。這可能是由于較長(zhǎng)時(shí)間的乙醇浸泡致使樣品中的大量甲醛被洗去，蛋白酶K的過夜反應(yīng)消化掉了與DNA交聯(lián)的蛋白質(zhì)，以及裂解后的90℃高溫水浴使之進(jìn)一步解交聯(lián)，從而使得循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)更順利地進(jìn)行。

然而，我們的方法還有許多可以改進(jìn)之處，如可使用梯度乙醇洗滌更長(zhǎng)時(shí)間［15-16］。使用酒精梯度置換法除去甲醛的原理是利用乙醇與甲醛之間反應(yīng)生成半縮醛或縮醛，通過設(shè)置梯度乙醇濃度替換液不斷置換出甲醛，從而更加有利于DNA的提取，而之后復(fù)水的過程主要是為了保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，此外，將90℃水浴處理提至蛋白酶K消化之前可以避免長(zhǎng)時(shí)間消化對(duì)DNA的影響, 且節(jié)省蛋白酶K的用量［17］。這種福爾馬林浸泡樣本中提取的DNA還存在序列偽影［3,18］，這給DNA測(cè)序后的序列比對(duì)設(shè)置了難題，導(dǎo)致我們無法判斷測(cè)序結(jié)果與模板的不一致是來源于生物體遺傳基因的改變還是甲醛的作用對(duì)樣本DNA造成的破壞。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，與普通福爾馬林相比，使用10%中性緩沖福爾馬林可使組織穩(wěn)定更長(zhǎng)的時(shí)間，這種溶液也被用于尸檢采樣［19-20］。