陳燦偉 范子文 黃帥 黃彥 瓦慶德 令狐熙濤 廖壯文

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科（廣州 510000）；2遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科（貴州 遵義 563000）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，前列腺癌骨轉(zhuǎn)移是晚期前列腺癌患者死亡的主要原因［1-2］。研究［3-5］發(fā)現(xiàn)90%的前列腺癌死亡患者均有發(fā)生不同程度的骨轉(zhuǎn)移，前列腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后導(dǎo)致劇烈疼痛、骨折等嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。晚期前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的主要治療策略包括放療、化療和手術(shù)等方法，然而患者治療后平均中位生存時(shí)間僅3～5年，因此急需尋找新的治療藥物來(lái)改善患者的預(yù)后［6］。天然萃取的小分子化合物具有良好的生物活性和較低的毒性與副作用，是抗腫瘤藥物的重要來(lái)源之一，研究發(fā)現(xiàn)從多種天然藥物中提取的黃酮類(lèi)生物化合物香葉木素具有抗炎、抗氧化、抗瘤等活性功能［7-8］。多項(xiàng)研究表明香葉木素可以通過(guò)誘導(dǎo)肺癌、肝癌及大腸癌等細(xì)胞的凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，但在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中少有研究，其對(duì)前列腺癌細(xì)胞的影響有待闡明［9-11］。因此本研究以PC-3 為研究對(duì)象，探索香葉木素對(duì)非激素依賴性前列腺癌PC-3 細(xì)胞的影響，為其作為潛在的抗前列腺癌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人前列腺癌PC-3 細(xì)胞株購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。香葉木素（純度≥98%）及DMSO 購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、細(xì)胞因子B27、EGF、bFGF 均購(gòu)自美國(guó)Gbico 公司；CCK8 試劑盒購(gòu)自美國(guó)AbMole 公司；單克隆抗體Caspase、Bax、Bcl2、β-acting 均購(gòu)自美國(guó)CST 公司；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒、ECL 發(fā)光液購(gòu)于碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物溶解香葉木素用DMSO 溶解成儲(chǔ)存液（儲(chǔ)存濃度為1 mg/mL），0.22 μm 過(guò)濾器除菌。

1.2.2 細(xì)胞增殖率測(cè)定將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液并以每孔100 μL（密度4×103個(gè)/孔）接種至96 孔板，培養(yǎng)過(guò)夜細(xì)胞貼壁后，藥物組分別加入5、10、15、20、25 μg/mL 的香葉木素，對(duì)照組加入100 μL 培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后每孔加入100 μLCCK8 稀釋液（每孔含10 μL 試劑原液），孵育2 h 用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置5 個(gè)副孔并重復(fù)3 次。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察將PC-3細(xì)胞懸液以每孔1 mL（密度1×104個(gè)/孔）接種至12 孔板，然后加入5、10 μg/mL 香葉木素，培養(yǎng)24 h 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.4 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)將PC-3細(xì)胞（每孔1 000個(gè)）接種到6 孔板中，貼壁后加入5、10 μg/mL 香葉木素處理24 h。然后棄去培養(yǎng)基更換新鮮培養(yǎng)基，每3 天更換一次培養(yǎng)基并維持14 d。待2 周后用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定20 min，PBS 清洗2 次后用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，最后拍照計(jì)數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞Transwell遷移實(shí)驗(yàn)將PC-3細(xì)胞（每孔1×105個(gè)）接種到6孔板中，貼壁后加入5、10 μg/mL香葉木素處理24 h。用無(wú)血清培養(yǎng)基將收集的細(xì)胞制成懸液后計(jì)數(shù)，并以5×104的密度接種至24 孔Transwell 上室中，下室加入含30%血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗2 次再用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，拍照后隨機(jī)選擇5 個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)將PC-3細(xì)胞（每孔1×105個(gè)）接種到6 孔板中貼壁后加入5、10 μg/mL 香葉木素處理24 h，然后分別收集每組細(xì)胞計(jì)數(shù)，以6×103的密度接種到經(jīng)FN 預(yù)處理24 h 的96 孔板中。培養(yǎng)3 h 后用PBS 洗滌細(xì)胞，然后用4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min 后顯微鏡下觀察拍照，隨機(jī)選擇5 個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.2.7 細(xì)胞成球試驗(yàn)將PC-3細(xì)胞（每孔1×105個(gè)）接種到6 孔板中，貼壁后加入5、10 μg/mL 香葉木素處理24 h，然后收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以1×103的密度接種至24 孔超低粘附培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)14 d 后拍照，并在顯微鏡下計(jì)數(shù)腫瘤球的數(shù)量（直徑＞50 μm）。

1.2.8 Western blot 分析將PC-3 細(xì)胞（每孔5×105個(gè)）接種到100 mm 培養(yǎng)皿中，貼壁后加入5、10 μg/ml 香葉木素處理24 h，然后棄去培養(yǎng)基，并用預(yù)冷的PBS 沖洗2 次。加入含有PMSF 和RIPA的PBS 緩沖液提取總蛋白，使用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品在12%的SDS-PAGE 中進(jìn)行電泳2 h，然后用PVDF 膜電轉(zhuǎn)1.5 h，并在5%脫脂牛奶中封閉60 min。將封閉后的PVDF 膜放在相應(yīng)的一抗（1∶1 000）中孵育過(guò)夜，水平搖床低速震蕩1 h 后TBST 洗膜液洗滌3 次，再放入相應(yīng)的二抗（1∶2 000）中搖床低速震蕩1 h。二抗孵育完成后TBST 洗膜液洗滌3 次并使用ECL 檢測(cè)系統(tǒng)曝光條帶，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0 和GraphPad 6.0統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 香葉木素對(duì)PC-3 細(xì)胞活力的影響采用CCK8 法測(cè)定細(xì)胞增殖率，分別用5、10、15、20、25 μg/mL 的香葉木素處理PC-3 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞增殖率較對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。香葉木素呈劑量效應(yīng)抑制PC-3 細(xì)胞在體外增殖（圖1）。

圖1 香葉木素抑制PC-3 細(xì)胞的增殖Fig.1 Diosmetin inhibited PC-3 cell proliferation in vivo

2.2 香葉木素對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響根據(jù)CCK8結(jié)果，分別用5、10 μg/mL 的香葉木素處理PC-3 細(xì)胞24 h 后，鏡下觀察到PC-3 細(xì)胞形態(tài)從規(guī)則梭形變成圓形并出現(xiàn)細(xì)胞碎片（圖2A）。此外通過(guò)WB檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Caspase 8、Bax 和抗凋亡基因Bcl-2 的表達(dá)，香葉木素能增加凋亡相關(guān)基因Caspase 8、Bax 的表達(dá)，而下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2 表達(dá)（圖2B）。

圖2 香葉木素誘導(dǎo)PC-3 細(xì)胞發(fā)生凋亡（×100）Fig.2 Diosmetin induces apoptosis in PC-3 cells（×100）

2.3 香葉木素對(duì)PC-3 細(xì)胞集落形成的影響采用克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定香葉木素對(duì)PC-3 細(xì)胞集落形成能力的影響，分別用5、10 μg/mL 的香葉木素處理PC-3 細(xì)胞24 h 再培養(yǎng)14 d 后，香葉木素能抑制PC-3 細(xì)胞集落形成能力（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 香葉木素抑制PC-3 細(xì)胞的集落形成能力Fig.3 Diosmetin inhibited the colony forming ability of the PC-3 cells

2.4 香葉木素對(duì)PC-3 細(xì)胞遷移的影響采用Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移變化，香葉木素處理PC-3 細(xì)胞后的細(xì)胞遷移能力顯著低于對(duì)照組 （P＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 香葉木素抑制PC-3 細(xì)胞的遷移（×100）Fig.4 Diosmetin inhibited migration of PC-3 cells（×100）

2.5 香葉木素對(duì)PC-3 細(xì)胞黏附的影響采用FN黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PC-3 細(xì)胞的黏附能力，用香葉木素處理PC-3 細(xì)胞24 h 后，處理組細(xì)胞黏附能力顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。

2.6 香葉木素對(duì)PC-3 細(xì)胞成球的影響采用懸浮培養(yǎng)檢測(cè)細(xì)胞成球能力，用香葉木素處理PC-3細(xì)胞24 h 后再懸浮培養(yǎng)14 d 后，結(jié)果所示處理組PC-3 細(xì)胞成球能力顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。

3 討論

細(xì)胞凋亡與增殖之間的失衡是腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞能抵抗和逃避藥物誘導(dǎo)的凋亡效應(yīng)是惡性腫瘤耐藥的主要機(jī)制之一，因此抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與誘導(dǎo)其凋亡是治療腫瘤的重要策略［12-14］。天然藥用植物提取的小分子藥物單體具有良好的生物活性、低毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，是一種重要的抗腫瘤藥物來(lái)源之一，香葉木素作為一種具有多重抗瘤功能活性的黃酮類(lèi)化合物，通常與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。AL-ABD 等［15］發(fā)現(xiàn)香葉木素通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期停滯在G2/M 期顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖，并抑制Bcl-2、cyclinB1 的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。CHOI 等［16］發(fā)現(xiàn)香葉木素可抑制B16F10腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并能下調(diào)血管生成素2 和周細(xì)胞覆蓋率有效抑制HUVEC細(xì)胞遷移和血管形成。本研究首先應(yīng)用CCK-8 法檢測(cè)了不同濃度的香葉木素對(duì)PC-3 細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香葉木素以濃度梯度顯著抑制PC-3 細(xì)胞的增殖，結(jié)果提示香葉木素能抑制PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖5 香葉木素抑制PC-3 細(xì)胞黏附（×100）Fig.5 Diosmetin inhibited PC-3 cells adhesion（×100）

圖6 香葉木素抑制PC-3 細(xì)胞球體形成（×50）Fig.6 Diosmetin inhibited PC-3 cells sphere formation（×50）

半胱天冬酶（caspase）是一類(lèi)含有半胱氨酸水解酶的蛋白家族，由caspase-2、8、9 和10 等組成，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)導(dǎo)和放大胞內(nèi)凋亡信號(hào)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，caspase-8 是外部凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵啟動(dòng)分子，激活caspase-8 酶活性能促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡［17-18］。此外在細(xì)胞內(nèi)，Bcl 蛋白家族被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過(guò)程中主要的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（Bcl-2）可抑制細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2 相關(guān)的X 基因（Bax）則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl2 與Bax 的比例與細(xì)胞凋亡發(fā)生有關(guān)［19-20］。在增殖結(jié)果的基礎(chǔ)上，用不同濃度的香葉木素繼續(xù)培養(yǎng)PC-3 細(xì)胞，然后通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，觀察到香葉木素處理PC-3 細(xì)胞24 h 后，PC-3 細(xì)胞形態(tài)從規(guī)則的梭形變成透明圓形并出現(xiàn)碎片，貼壁數(shù)量明顯減少。此外，還檢測(cè)了香葉木素處理對(duì)PC-3 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白caspase-8、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示香葉木素以劑量依賴性方式提高促凋亡相關(guān)基因Caspase 8、Bax 的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2 的表達(dá)，提示香葉木素通過(guò)調(diào)節(jié)caspase-8、Bcl-2 和Bax 的表達(dá)誘導(dǎo)PC-3 細(xì)胞發(fā)生凋亡。

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）是一群具有干細(xì)胞特征的癌細(xì)胞亞群，參與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥等進(jìn)展過(guò)程［21］。YUAN 等［22］發(fā)現(xiàn)DANCR可通過(guò)激活β-catenin 通路而促進(jìn)肝癌細(xì)胞HCC 的干細(xì)胞特性，從而增加腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。SANG等［23］研究表明在ID2 蛋白正向調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中HIF-α 的活性，當(dāng)ID2 蛋白被Thr27 磷酸化后，HIF-α 表達(dá)不穩(wěn)定從而使神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干性消失，腫瘤的生長(zhǎng)被顯著抑制。腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，除了CSCs 參與外，還包括腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處遷移并黏附于定植部位等特點(diǎn)［24］。體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)香葉木素呈劑量依賴性方式抑制PC-3 細(xì)胞的成球能力、集落形成能力等干細(xì)胞特性。此外，香葉木素以劑量依賴性方式抑制PC-3 細(xì)胞的黏附能力和遷移能力，這些結(jié)果表明香葉木素在體外可影響PC-3 細(xì)胞的干細(xì)胞特性及遷移能力。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)香葉木素能抑制非激素依賴性前列腺癌PC-3 細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，且還顯著抑制PC-3 細(xì)胞的干細(xì)胞特性及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示香葉木素在體外具有較好的抗前列腺癌活性。目前尚未探討其發(fā)揮抑制前列腺癌生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移作用的潛在機(jī)制和體內(nèi)抑瘤效果，因此在下一步研究中將會(huì)重點(diǎn)研究其抑制前列腺癌生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移作用的詳細(xì)機(jī)制，并通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其抗瘤活性，為香葉木素用于臨床治療前列腺癌及其骨轉(zhuǎn)移瘤提供充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。