楊悅，王艷艷，卞宏生，于爽，李廷利，黃莉莉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

黃莉莉(1978-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥生物活性及機(jī)制研究。

“虛煩不得眠”是酸棗仁湯主治證候。現(xiàn)代有關(guān)酸棗仁湯的藥理研究或單獨開展拮抗焦慮作用的研究，或單獨開展改善睡眠研究，這種研究模式難以闡明酸棗仁湯的藥理作用本質(zhì)。在當(dāng)前藥理研究中焦慮動物模型和失眠動物模型都是單獨復(fù)制，利用現(xiàn)有模型不能整體反映出“虛煩不得眠”的證候。基于這種現(xiàn)狀，復(fù)制“虛煩不得眠”的動物模型是全面闡明酸棗仁湯作用實質(zhì)的關(guān)鍵。因此我們利用條件性恐懼來復(fù)制動物的焦慮模型，并利用皮層腦電描記與分析技術(shù)分析其睡眠障礙的類型，以此來復(fù)制“虛煩不得眠”的動物模型，為今后酸棗仁湯的中藥藥理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(220±20)g，SPF級，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(黑)2018-007。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)獨立通氣籠IVC，自動定時光控系統(tǒng)實行12 h光照/12 h黑暗交替處理(7∶00 am開燈/7∶00 pm熄燈)，恒溫恒濕條件,濕度(50%±10%)，溫度(23±1)℃。4只/籠，可自由獲取食水。

1.2 主要儀器和設(shè)備

RU25H5型獨立通氣籠IVC，蘇州市蘇杭科技器材有限公司；XR-XC404型SuperFcs條件性恐懼實驗分析系統(tǒng)，上海欣軟信息科技有限公司；XR-XG201型大鼠高架十字迷宮裝置(EPM)，上海欣軟信息科技有限公司；MP-150型十六通道生理記錄儀，美國Biopac公司；51600大鼠腦立體定位儀，美國Biopac公司。

1.3 方法

1.3.1 分組與動物模型的復(fù)制

1.3.1.1 大鼠皮層腦電與肌電電極的埋置

4%水合氯醛將大鼠麻醉后，固定于腦立體定位儀，碘酒消毒頭部創(chuàng)口并剔除毛發(fā)，剪去頭部皮膚，酸蝕劑去除組織筋膜，鹽水清潔使充分暴露顱骨，待顱骨干潔時于前囟前1 mm，額骨中線旁開1.5 mm；人字縫前1 mm，頂骨中線旁開1.5 mm埋置2根皮層腦電電極，頸部肌肉埋置肌電電極，牙托粉固定后恢復(fù)1周，期間自由攝入食水。

1.3.1.2 條件性恐懼所致大鼠狀態(tài)性焦慮模型的復(fù)制

SD雄性大鼠隨機(jī)分為對照組和模型組，每組8只，IVC系統(tǒng)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，條件性恐懼刺激的前3天開始，每天同一操作人員撫摸大鼠 2～3 min，持續(xù)3 d，使大鼠習(xí)慣實驗人員。實驗于12∶00—18∶00進(jìn)行。第8天開始實驗。在條件性恐懼刺激前30 min，將實驗動物分單籠放置于條件性刺激裝置所在環(huán)境中適應(yīng)。每次抓取一只大鼠輕撫鼠背后提取鼠尾托住大鼠，使頭部正對箱門放入。刺激箱中適應(yīng)3 min后開始條件性刺激。模型復(fù)制方法采取5 s噪聲(1 000 Hz，75 dB)，第5 s持續(xù)1 s足底電擊共同終止的刺激方案(0.5 mA)，該事件循環(huán)發(fā)生15次，每次間隔1 min；對照組則只施加5 s噪聲而無電擊(1 000 Hz，75 dB)，其他實驗要求與模型組相同，循環(huán)15次，每次間隔1 min。每只動物實驗結(jié)束后于刺激箱中適應(yīng)3 min再放回原單籠，送回飼養(yǎng)室,并用10%的酒精擦除箱中的動物排泄物及殘留氣味。連續(xù)進(jìn)行4 d模型復(fù)制。

僵直反應(yīng)(Freezing)指標(biāo)的判斷：模型復(fù)制后翌日，將大鼠置于條件性刺激箱，適應(yīng)3 min后，記錄5 min內(nèi)每次聲信號后大鼠頭、軀體、四肢均不動的行為時間。

1.3.2 高架十字迷宮實驗方法與觀測指標(biāo)的判斷

測試于12∶00開始。在行為學(xué)測試前30 min，待測動物分單籠放置于EPM所在安靜環(huán)境中適應(yīng)。實驗開始時，將實驗動物置于EPM中央平臺區(qū)，面向一側(cè)開放臂釋放同時開始計時，每只動物自由探索5 min，通過錄像采集行為指標(biāo)，每次測試結(jié)束后將動物放回原籠送回飼養(yǎng)室，并用10%的酒精徹底清潔，去除動物排泄物和氣味。指標(biāo)的生物學(xué)意義與判斷方法如下[1-3]。

開放臂運動時間(Time in open arms)：直觀反映動物對高懸敞開環(huán)境的厭惡程度(四肢完全進(jìn)去任意開放臂的停留時間，直至四肢完全脫離開放臂)；

封閉臂運動時間(Time in closed arms)：直觀反映動物對相對封閉環(huán)境的偏好(四肢完全進(jìn)去任意封閉臂的停留時間，直至四肢完全脫離封閉臂)；

開放臂進(jìn)入次數(shù)(Open arm entries)：體現(xiàn)對新奇環(huán)境的探究性(四只爪完全進(jìn)去任意開放臂的頻次，只兩前肢進(jìn)入記為探究開臂)；

總?cè)氡鄞螖?shù)(Total arm entries)：總?cè)氡鄞螖?shù)可體現(xiàn)動物的運動活性，在無其他外因干擾下，次數(shù)減少反映為焦慮水平增加(四只爪完全進(jìn)去任意開放臂和封閉臂頻次之和)；

1.3.3 條件性恐懼所致大鼠狀態(tài)性焦慮持續(xù)時間及其睡眠-覺醒周期變化的研究

在上述實驗條件下，實驗動物經(jīng)歷連續(xù)4 d的條件性刺激。模型復(fù)制后的翌日開始首次條件性刺激后的EPM行為學(xué)測試(第1天)。所有實驗動物分別于條件性刺激后第1、7、10、14、21天進(jìn)行EPM中的行為學(xué)評價，錄像記錄相關(guān)行為參數(shù)。每日測試完成后連接十六通道生理記錄儀，連續(xù)描記24 h的腦電圖。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法

本研究應(yīng)用IBM SPSS Statistics 24軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；連續(xù)檢測數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，非正態(tài)性數(shù)據(jù)采用Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)(四分位距)統(tǒng)計描述。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠僵直反應(yīng)時間的變化

結(jié)果顯示，與對照組相比，造模后大鼠僵直反應(yīng)時間顯著增加(P<0.01)，見表1。

表1 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠僵直反應(yīng)時間的變化

2.2 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠EPM中的行為學(xué)變化

2.2.1 開放臂運動時間、封閉臂運動時間、開放臂進(jìn)入次數(shù)及總?cè)氡鄞螖?shù)的變化

與對照組相比，不同測試天數(shù)下的模型組大鼠開放臂運動時間于第1、7和10天顯著縮短(P<0.05)、開放臂進(jìn)入次數(shù)于第1、7、10、14天顯著降低(P<0.05)，總?cè)氡鄞螖?shù)于第1、7、10和21天顯著減少，封閉臂運動時間略有延長而未見明顯變化，見圖1。

注：與同期對照組比較，*P<0.05。圖1 條件性恐懼大鼠EPM中開放臂運動時間、封閉臂運動時間、開放臂進(jìn)入次數(shù)及總?cè)氡鄞螖?shù)的變化

2.2.2 進(jìn)入開放臂時間與次數(shù)比例的變化

與對照組相比，不同測試天數(shù)下的模型組大鼠開放臂進(jìn)入次數(shù)比例和運動時間比例均降低，其中第1 、7、10、14天呈顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

注：與同期對照組比較，*P<0.05。圖2 條件性恐懼大鼠EPM中開臂時間比例及次數(shù)比例的變化

2.3 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠覺醒-睡眠時間和睡眠時相的變化

2.3.1 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠覺醒-睡眠時間的變化

2.3.1.1 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第1、7、10、14、21天Wake時間的變化

與對照組相比，不同測試天數(shù)下狀態(tài)性焦慮大鼠的Wake時間明顯延長(P<0.01，P<0.05)，其中第1、7、10、14天大鼠Wake時間的變化更加明顯，結(jié)果見表2～表6。

表2 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第1天Wake時間變化

表3 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第7天Wake時間變化

表4 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第10天Wake時間變化

表5 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第14天Wake時間的變化

表6 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第21天Wake時間變化

2.3.1.2 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第1、7、10、14、21天NREMS時間的變化

與對照組相比，不同測試天數(shù)下狀態(tài)性焦慮大鼠的NREMS時間明顯縮短(P<0.01，P<0.05)，其中第1、7、10、14天大鼠NREMS時間的變化更加明顯，見表7～表11。

表7 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第1天NREM睡眠時間變化

表8 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第7天NREM睡眠時間變化

表9 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第10天NREM睡眠時間變化

表10 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第14天NREM睡眠時間變化

表11 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第21天NREM睡眠時間變化

2.3.1.3 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第1、7、10、14、21天REMS時間變化

與對照組相比，不同測試天數(shù)下狀態(tài)性焦慮大鼠REM睡眠時間明顯增加(P<0.01，P<0.05)，其中第1、7、10、14天大鼠REMS時間的變化更加明顯，見表12～表16。

表12 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第1天REM睡眠時間變化

表13 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第7天REM睡眠時間變化

表14 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第10天REM睡眠時間變化

表15 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第14天REM睡眠時間變化

表16 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠第21天REM睡眠時間變化

2.3.2 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠覺醒-睡眠時相比例的變化

與對照組相比，不同測試天數(shù)下狀態(tài)性焦慮大鼠的Wake時間比例于第7、10、14天明顯增加(P<0.01，P<0.05)，伴有NREMS時間比例第1、7、10、14天的明顯減少(P<0.01，P<0.05)和REMS時間比例第1天的明顯增加(P<0.05)，見表17。

表17 條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮大鼠覺醒-睡眠時相比例的變化

3 討論

酸棗仁湯出自漢·張仲景《金匱要略》，主治“虛勞，虛煩不得眠”。通過原著的溫習(xí)及參考相關(guān)文獻(xiàn)，我們認(rèn)為“虛勞，虛煩不得眠”的內(nèi)涵是“虛勞”，是“虛煩不得眠”病因病機(jī)之所在，而“虛煩不得眠”是“虛勞”的證候之一,這一推斷可從《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治六》分析得出?！把蕴搫诓∶}證并治六”篇中涉及脈證九條及方九首，通過對“脈證九條及方九首”進(jìn)行分析，“方九首”所治之病均為“血痹或虛勞病”，但不同的方主治證候各有不同，酸棗仁湯主治證候是“虛煩不得眠”，而且酸棗仁湯主治的“虛煩不得眠”之證候是一個整體不可分割。但是縱觀現(xiàn)代開展的有關(guān)酸棗仁湯的中藥藥理研究，不是基于其“虛煩”之癥單獨開展拮抗焦慮作用的研究，就是基于其“不得眠”之癥單獨開展改善睡眠作用的研究，這種研究范式，難以闡明酸棗仁湯的藥理作用本質(zhì)。我們認(rèn)為要想闡明酸棗仁湯的藥理作用本質(zhì)就必須圍繞酸棗仁湯主治“虛煩不得眠”這一特殊證候來開展?；诖?，復(fù)制“虛煩不得眠”這一動物模型就成為了闡明酸棗仁湯的藥理作用本質(zhì)的關(guān)鍵之所在。

在藥理研究中焦慮與失眠動物模型是分別復(fù)制的，故不能反映“虛煩不得眠”這一證候，而且無論是焦慮還是失眠動物模型的復(fù)制都各自存在許多不同的復(fù)制方法。我們基于酸棗仁湯所治“虛煩不得眠”之證候由肝血不足，陰虛內(nèi)熱而起。肝藏血，血舍魂，若肝血不足，魂不守舍，心失所養(yǎng)，則虛煩不眠，心悸不安；血虧陰虛，易生內(nèi)熱，虛熱內(nèi)擾，虛煩不安?！夺t(yī)學(xué)正傳》指出:“恐通腎，驚通心肝”。驚恐太過則可導(dǎo)致肝血不足，魂不守舍，心失所養(yǎng)，則虛煩不眠的認(rèn)知，利用條件性恐懼復(fù)制大鼠狀態(tài)性焦慮模型，并利用皮層腦電描記與分析技術(shù)，來復(fù)制“虛煩不得眠”證候的模型，為今后闡明酸棗仁湯的藥理作用本質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

在當(dāng)前中醫(yī)情志病證的實驗研究中多用行為學(xué)方法來判定[4-5]，其中焦慮動物模型大多借用國際上經(jīng)典的動物模型，包括高架十字迷宮、天敵暴露、孤養(yǎng)等非條件化模型，以及Geller-Seifter和Vogel飲水沖突實驗、防御性掩埋等條件化模型，條件性恐懼所致焦慮模型可作為焦慮動物模型的一種。DAVIS[6]發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷條件性恐懼訓(xùn)練動物的行為表現(xiàn)，與臨床焦慮癥患者的表征是相似的。其理論基礎(chǔ)是條件性刺激引發(fā)動物對已知但又不可預(yù)期事件的恐懼和焦慮，可模仿人類生理反應(yīng)的行為表型(僵直或回避)，且苯二氮類、巴比妥類、阿片類、SSRI等均已表現(xiàn)出對條件性恐懼模型的抗焦慮活性。

動物模型的效果為暫時性的生理改變，隨時間推移造模效果趨于消散，明確焦慮動物模型的持續(xù)時間，以便更合理應(yīng)用于實驗研究，對焦慮發(fā)病機(jī)制和有關(guān)藥物評價研究具重要意義。就目前21 d行為學(xué)測試周期的研究結(jié)果可知，條件性恐懼可增加大鼠對厭惡環(huán)境的恐懼程度和對安全區(qū)域的偏好，并伴有運動性水平的降低，整體行為呈現(xiàn)明顯的探究性抑制，模型效果隨時間延長逐漸消退[7-8]，前14天更顯著的焦慮行為指標(biāo)提示14 d內(nèi)更明顯的焦慮水平。以往條件性恐懼模型多在訓(xùn)練后短期內(nèi)爭取模型效果消退前的藥效評價[9-10]。雖然中藥在治療焦慮上有很好的療效，且與化學(xué)合成藥相比，中醫(yī)藥治療具有個體化用藥、治療多靶點多途徑的優(yōu)勢[11-13]，但存在起效慢、給藥周期長的特點，明確條件性恐懼誘導(dǎo)大鼠狀態(tài)性焦慮模型的持續(xù)時間,為今后中藥藥效治療而非預(yù)防作用的評價提供方法學(xué)借鑒。

睡眠障礙常作為廣泛性焦慮癥的一項癥狀學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，而睡眠又是多項指標(biāo)代表的復(fù)雜過程，腦電圖是睡眠測量的客觀手段，焦慮癥患者的睡眠問題體現(xiàn)在入睡潛伏期延長，總睡眠時間和睡眠深度降低，睡眠連續(xù)性不佳等[14]。中醫(yī)在探討情志學(xué)說時常出現(xiàn)“不寐”“不得眠”的證候，如《類證治裁·不寐》曰：“思慮傷脾,脾血虧損,經(jīng)年不寐”；《景岳全書·不寐》談到：“無邪而不寐者,必營氣不足也,營主血,血虛則無以養(yǎng)心,心虛則神不守舍”；《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治第六》篇指出：“虛勞虛煩不得眠，酸棗湯主之”；《傷寒論·辨太陽病脈證并治》第76條提到：“發(fā)汗吐下后,虛煩不得眠，若劇者，必反復(fù)顛倒，心中懊惱,梔子豉湯主之”等。表明了情志不遂，勞動思慮太過誘發(fā)失眠的病因，說明焦慮癥與虛勞不寐之間一定的相關(guān)性[15-16]。本研究在狀態(tài)性焦慮模型復(fù)制基礎(chǔ)上進(jìn)行睡眠監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)狀態(tài)性焦慮大鼠伴有以高覺醒和NREMS減少為主要特征的睡眠-覺醒周期變化，REMS于模型后第1天有明顯增加，后期略有減少。相關(guān)報道指出，NREMS在抵御焦慮癥的發(fā)展中扮重要角色，NREMS紡錘波和κ復(fù)合波階段是記憶鞏固的關(guān)鍵過程，慢波睡眠階段具焦慮緩和作用，而高度焦慮個體表現(xiàn)為NREMS百分比降低[17]。REMS在情境記憶鞏固中起關(guān)鍵作用，REMS壓力包括更短的REM潛伏期，更多的REM密度和REM睡眠持續(xù)時間，但有關(guān)REMS的探討缺乏一致性，不同的睡眠深度和REM改變可能反映不同的癥狀[18]。明確條件性恐懼所致狀態(tài)性焦慮對睡眠-覺醒周期的影響，為闡明“虛煩不得眠”證候的科學(xué)實質(zhì)提供實驗依據(jù)，為今后開展中醫(yī)焦慮性失眠的相關(guān)研究增設(shè)了平臺基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究通過條件性恐懼方法誘導(dǎo)大鼠的狀態(tài)性焦慮模型，并觀察其睡眠時相的變化，“虛煩不得眠”證候主要表現(xiàn)為狀態(tài)性焦慮并發(fā)的睡眠時相障礙性改變。在探討中醫(yī)焦慮性失眠研究中，可作為中藥治療而非預(yù)防作用的評價手段。