段世宇，潘 永，楊 陽，張家莉，楊 琦,3*，周碧君,3*

（1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病研究室，貴州 貴陽 550025；3.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

0 引言

STM是沙門菌的一個重要血清型，是引起人畜胃腸炎的一種主要病原菌，其感染發(fā)病率居沙門菌感染的首位，約占食源性沙門菌感染的50%～70%［1］。近些年來，高通量技術(shù)進步使得sRNA出現(xiàn)，代表了原核生物中最重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑類別。sRNA的長度在50~200個核苷酸（nt）之間，大多數(shù)sRNA具有多個靶標(biāo)，通過與靶標(biāo)信使RNA（mRNA）堿基配對起作用［2］。小調(diào)節(jié)RNA（sRNA）作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)基因表達的多個方面，如轉(zhuǎn)錄、翻譯、mRNA穩(wěn)定性和DNA維持或沉默［3］。Hfq是大多數(shù)細菌中普遍存在的Sm樣RNA結(jié)合蛋白，最明顯的功能是作為RNA匹配器的作用，可促進sRNA與其mRNA靶標(biāo)之間的堿基配對，也可直接結(jié)合、調(diào)節(jié)某些mRNA的翻譯［4］。

STM和大腸桿菌一樣，在大量與伴侶蛋白Hfq和sRNA相關(guān)的研究中被用作模式菌株［5］。一直以來STM中有關(guān)伴侶蛋白Hfq依賴性sRNA GcvB轉(zhuǎn)錄后調(diào)控其靶基因作用機理的研究是學(xué)者們的主要研究熱點，而關(guān)于STM Hfq與GcvB靶基因作用的研究相對較少。在大腸桿菌中，已證明Hfq可獨立于sRNA調(diào)控靶mRNA表達［6］。二肽或氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白OppA作為STM較為重要的蛋白分子，當(dāng)STM處于營養(yǎng)較為豐富的環(huán)境中時，STM sRNA GcvB可在伴侶蛋白Hfq的協(xié)助下直接抑制其表達［7-8］。此前研究已證明STM OppA mRNA受GcvB直接調(diào)控且具體的作用位點已被闡明，而當(dāng)GcvB不存在時，Hfq是否擁有對其獨立調(diào)控的能力，目前為止，尚未有相關(guān)研究闡明［9］。鑒于OppA基因在STM中的蛋白水平較高，有利于后續(xù)的蛋白水平檢測，本研究將利用λ-Red同源重組酶和FLP重組酶介導(dǎo)的DNA重組技術(shù)構(gòu)建STM OppA::lacZ基因融合菌株，運用噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的Hfq或GcvB基因的完整缺失，通過qRT-PCR和β-半乳糖苷酶試驗分別檢測OppA基因轉(zhuǎn)錄和蛋白水平，判斷Hfq是否可獨立于GcvB調(diào)控OppA mRNA，為后續(xù)STM Hfq與OppA mRNA的作用機制探究提供理論和材料支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與質(zhì)粒

MA3409菌株（STM LT2 wild type）、MA7455菌株（STM LT2/pKD46）、MA10241菌株（STM LT2 ΔGcvB::cat）、MA10675菌株（STM LT2 ΔHfq::tetRA）、P22噬菌體、pKD13質(zhì)粒、pCP20質(zhì)粒及pCE40質(zhì)粒均由法國國家科學(xué)研究中心（CNRS）分子遺傳學(xué)Bossi實驗室惠贈。

1.2 主要試劑

氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、鹽酸四環(huán)素、利福平、Pfu DNA Polymerase、Taq DNA Polymerase、dNTPs Mix 及ONPG均購自北京索萊寶科技有限公司。甲苯申請并報備于貴州大學(xué)實驗室與設(shè)備管 理 處。DL2000 Plus DNA Marker、AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix和膠回收試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。Cycle-Pure Kit和Bacterial RNA Kit （R6950）購自O(shè)mega生物科技有限公司。NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix （gDNA Purge）購自近岸蛋白生物科技有限公司。

2 方法

2.1 引物設(shè)計與合成

登錄NCBI網(wǎng)站獲取STM LT2菌株的全基因序列（GeneID：AE006468.2），根據(jù)基因序列設(shè)計引物，引物由Primer select軟件設(shè)計并由上海生工生物工程有限公司合成（表1）。

表1 引物列表

2.2 OppA::lacZ基因融合菌株的構(gòu)建

以P1/P2為引物，pKD13為模板，PCR擴增用于與OppA基因部分編碼區(qū)替換的目的片段，利用λ-Red同源重組技術(shù)及FLP重組酶系統(tǒng)，將編碼半乳糖苷酶的lacZ基因克隆至STM LT2 OppA基因編碼區(qū)，使lacZ基因伴隨OppA基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達。

2.3 P22噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)

通過噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將MA10675菌株中替換Hfq完整基因序列的四環(huán)素片段和MA10241菌株中替換GcvB完整基因序列的氯霉素片段分別或同時轉(zhuǎn)導(dǎo)至STM LT2 OppA::lacZ菌株。

2.4 Touch-down PCR反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳試驗

上述涉及重組菌株的構(gòu)建與鑒定的PCR反應(yīng)均采用Touch-down PCR反應(yīng)程序：95 ℃、6 min；95℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、90 s，5個循環(huán)；95 ℃、10 s，53 ℃、30 s，72 ℃、90 s，20個循環(huán)；72 ℃、8 min。結(jié)束后分別取以同一菌株總DNA為模板不同引物擴增的產(chǎn)物10 μL混合于200 μL PCR管，取20 μL混合產(chǎn)物進行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳。

2.5 qRT-PCR反應(yīng)

根據(jù)Omega公司生產(chǎn)的Bacterial RNA Kit （R6950）試劑盒提取相應(yīng)細菌的總RNA樣本，再使用近岸蛋白質(zhì)科技有限公司生產(chǎn)的NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（gDNA Purge）試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

普通PCR對熒光定量PCR引物P12/P13（OppA基因）和 P14/P15（16 S rDNA基因）進行特異性檢測，反應(yīng)程序為：95 ℃、6 min；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，20個循環(huán)；72℃、1 min。取擴增產(chǎn)物10 μL進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

以制備的cDNA為模板，進行qPCR擴增反應(yīng)，檢測不同菌株OppA基因轉(zhuǎn)錄水平。反應(yīng)體系為：AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5.0 μL；cDNA（200 ng/μL） 2.0 μL；上游引物（10 μM）0.5 μL；下游引物（10 μM） 0.5 μL；ddH2O 2.0 μL。反應(yīng)程序為：95℃、5 min；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40個循環(huán)。每組設(shè)3個重復(fù)，以16 S rDNA為內(nèi)參基因，以STM LT2 OppA::lacZ菌株為對照。最終采用相對比較法，即ΔΔCT法（Qr=2-ΔΔCt）計算分析數(shù)據(jù)［10］。

2.6 β-半乳糖苷酶活性的檢測

參考Griffith等［11］的方法，檢測lacZ基因表達的β-半乳糖苷酶活性，每組設(shè)3個重復(fù)并設(shè)STM LT2 OppA::lacZ菌株為陰性對照，同時設(shè)空白對照。將lacZ基因融合菌株過夜培養(yǎng)復(fù)蘇，次日取100 μL到新的LB中培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600nm≈0.5），取0.1 mL菌液至一個新的試管，加0.9 mL的Z buffer，對照組加1 mL的Z buffer，向試管中等量滴加1~3滴甲苯，立即旋轉(zhuǎn)振蕩30 s，然后放到42 ℃水浴搖床震蕩2~3 h，再置于28 ℃水浴5 min后加入100 μL ONPG（8 mg/mL）并記錄時間為t1，待溶液變黃，立即加入0.5 mL 1 mol/L Na2CO3終止液并記錄時間為t2。將試管中終止所得液體進行一次離心，取上清液 1 mL置于比色皿中，以Z buffer作為空白對照，測OD420，記錄數(shù)值。按公式（1000×OD420/ （t2- t1）×0.1×OD600）計算β-半乳糖苷酶活性。

3 結(jié)果

3.1 STM LT2 OppA::lacZ菌株的構(gòu)建結(jié)果

利用λ-Red同源重組酶及FLP重組酶系統(tǒng)，構(gòu)建STM LT2 OppA基因和lacZ基因融合菌株。PCR鑒定結(jié)果顯示，STM LT2 OppA::kn、STM LT2 OppA::scar和STM LT2 OppA::lacZ重 組 菌 株 均出現(xiàn)了與預(yù)期大小相符的目的條帶。測序結(jié)果顯示，STM LT2 OppA::kn、STM LT2 OppA::scar和STM LT2 OppA::lacZ重組菌株目的條帶大小分別為892 bp（P1/P2）、1050 bp（P3/ P4）和 250 bp（P6/P7），與預(yù)期大小完全相符（圖1）。測序峰圖顯示，lacZ基因已成功與OppA基因融合重組（圖2）。麥康凱固體培養(yǎng)基結(jié)果顯示，與野生型菌株MA3409相比，STM LT2 OppA::lacZ重組菌株呈現(xiàn)紅色菌落（圖3），具備發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸的能力。以上結(jié)果表明，STM LT2 OppA基因和lacZ基因的融合菌株已正確構(gòu)建。

圖1 重組菌株的PCR電泳結(jié)果

圖2 測序峰圖

圖3 麥康凱鑒別培養(yǎng)基生長情況

3.2 STM LT2 OppA::lacZ菌株GcvB和Hfq單基因及雙基因缺失菌株的構(gòu)建結(jié)果

以STM LT2 OppA::lacZ菌株為受體菌，MA10241或MA10675為供體菌，利用P22噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)構(gòu)建STM LT2 OppA::lacZ菌株gcvB基因缺失、Hfq基因缺失以及GcvB和Hfq基因雙缺失菌株。PCR鑒定結(jié)果顯示，STM LT2 OppA::lacZ ΔGcvB::cat、STM LT2 OppA::lacZ ΔHfq::tetRA和STM LT2 OppA::lacZ ΔGcvB::cat ΔHfq::tetRA菌株均出現(xiàn)了與預(yù)期相符的目的條帶。測序結(jié)果顯示，STM LT2 OppA::lacZ ΔGcvB::cat菌株目的條帶大小分別為696 bp（P8/P9）和250 bp（P6/P7）；STM LT2 OppA::lacZ ΔHfq::tetRA菌株目的條帶大小分別為1964 bp（P10/P11）和250 bp（P6/P7）；STM LT2 OppA::lacZ ΔGcvB::cat ΔHfq::tetRA菌株目的條帶大小分別為1964 bp（P10/P11）、696 bp（P8/P9）和250 bp（P6/P7），與預(yù)期大小完全相符（圖4）。結(jié)果表明，STM LT2 OppA::lacZ菌株GcvB基因缺失、Hfq基因缺失以及GcvB和Hfq基因雙缺失菌株已正確構(gòu)建。

圖4 STM LT2 OppA::lacZ菌株GcvB、Hfq基因單缺失及雙缺失后PCR電泳結(jié)果

3.3 GcvB和Hfq基因單缺失和雙缺失對OppA基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

對OppA和16 S rDNA基因的熒光定量PCR引物特異性進行檢測。PCR鑒定結(jié)果顯示，所有目的條帶單一，無雜帶及引物二聚體（圖5）。測序結(jié)果顯示，目的條帶大小分別為153 bp（P12/P13）和133 bp（P14/P15），與預(yù)期目的條帶大小完全相符（圖5）。結(jié)果表明，OppA和16 S rDNA熒光定量PCR引物均滿足試驗要求。

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與WT相比，缺失GcvB基因使OppA基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)4.4倍（圖5）；缺失Hfq基因使OppA基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)6.5倍（圖6）；GcvB和Hfq雙基因缺失使OppA基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)6.8倍（圖6）。結(jié)果表明，Hfq和GcvB對OppA轉(zhuǎn)錄水平具有負(fù)調(diào)控作用。

圖5 引物特異性PCR電泳結(jié)果

圖6 STM LT2 OppA::lacZ菌株GcvB、Hfq基因單缺失或雙缺失后OppA基因轉(zhuǎn)錄水平的qRT-PCR檢測結(jié)果

3.4 GcvB和Hfq基因單缺失和雙缺失對OppA基因蛋白水平的影響

測定OppA::lacZ基因融合菌株β-半乳糖苷酶活性。結(jié)果顯示，與WT相比，敲除GcvB基因使OppA蛋白水平上調(diào)5.4倍（圖7）；敲除Hfq基因使OppA蛋白水平上調(diào)6.0倍（圖7）；同時敲除GcvB和Hfq基因使OppA蛋白水平上調(diào)了8.3倍（圖7）。結(jié)果表明，Hfq和GcvB均對OppA蛋白水平具有負(fù)調(diào)控作用。

圖7 重組菌株β-半乳糖苷酶測定結(jié)果

4 討論

Hfq在細菌 RNA代謝中起著多種作用。這些作用包括通過促進mRNA的多聚腺苷酸化使mRNA不穩(wěn)定［12］、穩(wěn)定小調(diào)節(jié)RNA （sRNA）以防止sRNA降解［13］、不依賴ATP可促進 sRNA與mRNA堿基配對［14］，Hfq還可以直接結(jié)合某些mRNA并調(diào)節(jié)它們的翻譯［15-16］。沙門氏菌中大量基因的表達受Hfq影響，hfq突變體使許多蛋白發(fā)生顯著的變化，其中包括 OMP，如OmpD、鞭毛蛋白FliC和許多周質(zhì)蛋白，周質(zhì)蛋白是鼠傷寒沙門氏菌的寡肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中不可缺少的功能蛋白，OppA基因編碼的蛋白質(zhì)是周質(zhì)中最豐富的蛋白質(zhì)之一［17］。Alexandra Sittka等［18］研究發(fā)現(xiàn)Hfq的缺失影響了周質(zhì)蛋白群體的組成，確定了Hfq對ompD mRNA有極強的親和力。鑒于Hfq最近作為一種小RNA結(jié)合蛋白受到了廣泛關(guān)注［19］，Hfq缺失使周質(zhì)蛋白的改變也讓人感興趣。并且Hfq及GcvB對OppA基因作用的分子機制仍然未知。本研究旨在探索Hfq及GcvB對OppA基因的作用機制。

20世紀(jì)80年代，Norton等［20］將大腸桿菌表達β-半乳糖苷酶的lacZ基因與勞斯肉瘤病毒相應(yīng)基因構(gòu)建為融合質(zhì)粒并與病毒一同轉(zhuǎn)染細胞，通過檢測β-半乳糖苷酶的表達活性可分析所研究基因的復(fù)制和表達特點。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，lacZ基因的融合技術(shù)可直接被利用在染色體的某個基因上。20世紀(jì)初，Ellermeier等［21］利用FLP酶介導(dǎo)FRT位點特異性重組的特性，構(gòu)建了針對lacZ基因靶向轉(zhuǎn)錄和翻譯融合的質(zhì)粒pCE40。該質(zhì)粒僅有一個FRT位點，位點后為已刪除5′UTR的lacZ基因，而pCE40將在FLP酶的作用下通過自身FRT位點與染色體上目標(biāo)基因唯一的FRT位點融合，目標(biāo)基因的FRT位點則最先通過λ-Red同源重組技術(shù)而整合到目標(biāo)基因CDS區(qū)，完成融合的lacZ基因?qū)⑴c目標(biāo)基因共用5′UTR，隨著目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄而轉(zhuǎn)錄，翻譯而翻譯。本研究構(gòu)建的OppA-lacZ基因融合菌株在麥康凱鑒別培養(yǎng)基上生長出明顯的紅色菌落，表明該菌株已成功構(gòu)建，對OppA-lacZ基因融合菌株進行β-半乳糖苷酶活性的測定，即可分析OppA基因蛋白水平，更方便地代替了Western Blot試驗。

本實驗中，為明確Hfq與GcvB對其靶基因OppA調(diào)控的重要性，構(gòu)建了Hfq和GcvB基因的單缺失和雙缺失菌株。結(jié)果顯示，OppA基因轉(zhuǎn)錄和蛋白水平與野生型菌株相比均出現(xiàn)了超過4倍的上調(diào)，說明伴侶Hfq和sRNA GcvB對OppA的表達均有重要的負(fù)調(diào)控作用。Pulvermacher等［22］對大腸桿菌Hfq和GcvB基因進行同樣的單缺失和雙缺失處理，通過測定堿性磷酸酶活性分析OppA基因蛋白水平，結(jié)果顯示：OppA基因蛋白水平與野生型菌株相比產(chǎn)生了超過4倍的上調(diào)變化，也證明了Hfq和GcvB調(diào)節(jié)OppA基因表達的重要性。Sharma等［9］通過體內(nèi)體外實驗證實了沙門菌中GcvB靶向OppA mRNA核糖體結(jié)合位點內(nèi)部和上游的富含C/A的序列來調(diào)節(jié)OppA mRNA的翻譯，而且Hfq對GcvB的穩(wěn)定性顯得極為重要。大量關(guān)于Hfq的研究表明，Hfq在細菌中以六聚體形式存在，它的作用目前被認(rèn)同的有3種：同時與sRNA和mRNA結(jié)合，改變sRNA與其靶mRNA的空間構(gòu)象，促進退火；直接與靶mRNA關(guān)鍵位點結(jié)合，抑制或促進mRNA的翻譯；直接與sRNA關(guān)鍵位點結(jié)合，增強sRNA的穩(wěn)定性，避免被核酸酶降解［23-25］。研究中發(fā)現(xiàn)：Hfq和GcvB基因雙缺失菌株OppA轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均略高于單缺失菌株，說明Hfq和GcvB調(diào)控OppA mRNA的作用可能是疊加的，進而推測Hfq在不存在GcvB時，對OppA mRNA同樣可調(diào)節(jié)，若為直接作用則可能有關(guān)鍵結(jié)合位點，該關(guān)鍵結(jié)合位點有待進一步研究。本研究驗證了Hfq可獨立于GcvB對OppA基因進行調(diào)控，也驗證了Hfq及GcvB在STM TL2中在寡肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)功能域有作用。該研究擴大了蛋白Hfq的調(diào)節(jié)范圍。為進一步闡述Hfq及GcvB在STM LT2中的調(diào)控機制和功能奠定了基礎(chǔ)。