盧麗娜，何鵬飛*，何鵬搏，李詠梅，夏夢媛，李興玉，王躍虎，吳毅歆*，何月秋*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201；2.中國科學(xué)院 昆明植物研究所 資源植物與生物技術(shù)重點實驗室，云南 昆明 650201）

解淀粉芽孢桿菌作為一類重要的根際微生物，在其生長代謝過程中會分泌多種抑菌物質(zhì)［1］，包括脂化類、多烯類、氨基酸類及核酸類等次生代謝物及揮發(fā)性物質(zhì)［2-5］。這些抗菌物質(zhì)能夠有效抑制細(xì)菌、真菌及病毒等的生長與增殖，是芽孢桿菌在土壤中抑制病原菌的重要武器［6］。脂肽類抗生素是其中最為常見的一類抑菌化合物。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，芽孢桿菌脂肽類抗生素被劃分為伊枯草菌素（iturin）家族［7］、表面活性素（surfactin）家族［8］、芬薺素（fengycin）家族［9］以及一些結(jié)構(gòu)未知的環(huán)狀分子。surfactin對細(xì)菌和病毒表現(xiàn)出很強(qiáng)的拮抗活性，具有很強(qiáng)的溶血活性，但是對真菌的拮抗能力較弱［10］。Xiong等［11］發(fā)現(xiàn)由Bacillus subtilis JK6產(chǎn)生的surfactin對番茄青枯病原菌具有很強(qiáng)的拮抗活性。fengycin對絲狀真菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑菌活性，但對酵母或細(xì)菌沒有抗生素活性［12］。iturin在離體環(huán)境下?lián)碛泻軓?qiáng)的抗真菌能力和溶血能力，但是對細(xì)菌和病毒的拮抗活性較弱。桿菌霉素D（Bacillomycin D）屬于iturin家族，它與iturinA的結(jié)構(gòu)類似，但氨基酸組成不同，也是目前已知的在微生物次生代謝產(chǎn)物中唯一能抑制黃曲霉（Aspergillus flavus）的化合物［13］。脂肽類抗生素除了對病原菌具有直接的拮抗作用外，還參與誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生抗性、運動性（motility）、生物膜（biofilm）形成，以及芽孢桿菌在寄主植物上的定殖［14］。芽孢桿菌的生防能力與其能否在寄主植物體內(nèi)以及在其他環(huán)境穩(wěn)定地定殖息息相關(guān)。芽孢桿菌在植物體環(huán)境的定殖涉及到趨化運動、對寄主植物防衛(wèi)反應(yīng)的壓制（耐受/逃逸），以及生物膜的形成等諸多環(huán)節(jié)［15-16］。先前有研究顯示桿菌霉素D為貝萊斯芽孢桿菌SQR9的生物膜形成所必需［17］。相關(guān)研究結(jié)果證實在缺乏surfactin后B. subtilis UMAF 6614不能在甜瓜葉片表面形成復(fù)雜的生物膜并且穩(wěn)定定殖［18］。因此，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類抗生素在不同程度上參與了菌株在寄主植物上的定殖過程，研究脂肽類抗生素在枯草芽孢桿菌定殖過程中的作用，有助于深入了解枯草芽孢桿菌的生防機(jī)制。雖然有很多研究報道指出脂肽類能夠殺菌，但是對其殺菌對象的范圍以及作用機(jī)理研究并不太多，這嚴(yán)重阻礙了芽孢桿菌的針對性使用；雖然已經(jīng)認(rèn)識到桿菌霉素和芬薺素對生物膜的形成很重要，但更多的是停留在室內(nèi)研究上，缺乏對植物體環(huán)境下的生物膜研究。

B9601-Y2（以下簡稱Y2）是本實驗室從小麥根際土壤中分離到的1株解淀粉芽孢桿菌。前期的研究發(fā)現(xiàn)此菌株除在盆栽和大田試驗中表現(xiàn)出顯著的促生、防病效果外，還能夠分泌包括桿菌霉素D和芬薺素在內(nèi)的多種脂肽類物質(zhì)，但尚未明確這些脂肽類抗生素在Y2發(fā)揮植物益生活性中所扮演的角色。為此，本研究通過同源重組敲除Y2染色體內(nèi)部的桿菌霉素D合成基因，比較觀察了脂肽類突變體抗真菌活性的變化，探測了其在小麥近緣作物——玉米及其根際環(huán)境的定殖動態(tài)，以期為更好地應(yīng)用此生防細(xì)菌及后續(xù)工程改造提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供式菌株和培養(yǎng)條件 大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）B9601-Y2-comK（簡 稱Y2-comK，攜帶pHT01-comK）、ΔbmyA，以及病原真菌香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubensis）均由本實驗室構(gòu)建或分離。

若無特別說明，供試的病原真菌使用PDA平板于28 ℃培養(yǎng)；大腸桿菌和芽孢桿菌置于37 ℃（未）含有抗生素的LB液（固）體培養(yǎng)基中生長，其中液體培養(yǎng)時的轉(zhuǎn)速為160 r/min。Y2的相關(guān)突變體均是以Y2-comK為初始菌株構(gòu)建的，培養(yǎng)時所使用的抗生素種類及其終濃度分別為氯霉素（Chloramphenicol）10 μg/mL、卡那霉素（Kanamycin）30 μg/mL、紅霉素（Erythromycin）20 μg/mL及氨芐青霉素（Ampicillin）100 μg/mL。

本研究所使用的質(zhì)粒pUC19及pMD18-ermR由本實驗室保存；綠色熒光蛋白質(zhì)粒pHAPII由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)沈其榮教授饋贈。

1.1.2 引物序列的合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中解淀粉芽孢桿菌Y2的全基因組序列信息（HE77 4679.1），利用軟件Primer 5設(shè)計出本研究所使用的引物（表1），隨后交由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 引物序列的情況

1.2 實驗方法

1.2.1 Y2桿菌霉素D合成缺陷突變體ΔbmyA的構(gòu)建 利用酚仿法［19］從Y2菌株的LB過夜培養(yǎng)物中提取Y2-comK的基因組DNA。以Y2-comK基因組DNA為模板，使用引物對bmyA-F/bmyA-R從中擴(kuò)增出桿菌霉素D（Bacillomycin D）生物合成基因簇基因成員bmyA的部分序列（1.6 kb，中間含有BamHI單一切點）；根據(jù)生產(chǎn)廠家的使用說明書，利用膠回收試劑盒（上海生工）回收PCR產(chǎn)物；分別使用EcoRI/XhoI和EcoRI/SalI酶切上述回收的bmyA PCR產(chǎn)物和pUC19，產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化后在T4連接酶作用下連接；次日，轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，篩選出含有中間載體pUC19-bmyA的陽性轉(zhuǎn)化子；BamHI單切pMD18-ermR，然后將回收到的紅霉素抗性套件（ermR）插入到含有相同黏性末段的pUC19-bmyA內(nèi)部，獲得最終的bmyA敲除自殺型質(zhì)粒pUBE。

參考前人的實驗方法，將敲除載體pUBE導(dǎo)入到Y(jié)2-comK的自然感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，取適量的菌液涂布于含有紅霉素的LB固體平板，在37 ℃下培養(yǎng)16~36 h。利用引物對bmyA-F/R檢測抗性轉(zhuǎn)化子的陰陽性，以Y2野生型基因組DNA為對照。此外，還使用HPLC-MS進(jìn)一步檢測轉(zhuǎn)化子桿菌霉素D的合成情況。將最終獲得的陽性轉(zhuǎn)化子命名為Y2 ΔbmyA。

1.2.2 Y2及其ΔbmyA突變體生長曲線的測定 將野生型Y2與突變體ΔbmyA分別在LB平板上劃線，在37 ℃下培養(yǎng)24 h；待其分別長出單菌落后，挑取少量新鮮單菌落，將其接入50 mL液體LB培養(yǎng)基中，在37 ℃下以160 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)12 h，制成種子液；借助紫外分光光度計，用新鮮無菌液體LB將種子液的濃度統(tǒng)一調(diào)整至OD600為1.0；然后按1%的接種比例將種子液分別轉(zhuǎn)接至裝有300 mL液體LB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在37 ℃下以160 r/min振蕩培養(yǎng)；此試驗每個處理重復(fù)3次。在轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后的0~24 h，每隔2 h測定1次溶液的OD600值；在培養(yǎng)后的24~40 h每隔4 h測定1次；在40~124 h每隔12 h測定1次。以吸光值為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，分別繪制Y2野生型與突變體的生長曲線，比較2個生長曲線的差異。

1.2.3 Y2ΔbmyA突變體的HPLC-MS檢測 從-80℃冰箱取出Y2野生型及其脂肽類突變體的甘油菌，劃線于含相應(yīng)抗生素的LB瓊脂平板，過夜培養(yǎng)。次日，挑取單菌落，接種至含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，在37 ℃下以160 r/min培養(yǎng)24 h。按1∶20的體積比轉(zhuǎn)接入Landy培養(yǎng)基，在30 ℃下以170 r/min培養(yǎng)60 h。參考前人的方法（略有改動），利用酸沉淀法提取解淀粉芽孢桿菌合成的脂肽類化合物，具體操作如下：在4 ℃下以12000 r/min離心10 min，然后收集上清液；利用6 mol/L HCl將上清液的pH值調(diào)至2.0，在4 ℃下過夜放置；在4 ℃下以8000 r/min離心20 min，收集沉淀；真空冷凍干燥沉淀，加入甲醇浸提，合并抽提液；甲醇粗提物冷凍干燥后，加入適量體積的甲醇溶解，使用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，獲得無菌粗提物；使用UltimateAQ-C18色譜柱，進(jìn)樣5 μL，梯度洗脫流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長為210 nm。流動相A和流動相B分別為乙腈和0.5%TFA（三氟乙酸）水溶液。洗脫程序如表2所示。

表2 梯度洗脫程序

1.2.4 Y2ΔbmyA對香蕉枯萎病菌的拮抗活性測定采用平板對峙法觀測Y2脂肽類合成缺陷突變體對香蕉枯萎病菌的拮抗活性。利用直徑為9 mm的打孔器在生長于PDA平板3 d的尖孢鐮刀菌菌落邊緣處打取菌餅，隨后使用無菌挑針將菌餅轉(zhuǎn)接入PDA平板的中央，使長有菌絲的一面緊貼于PDA培養(yǎng)基。在28 ℃下培養(yǎng)1 d后，在距離菌餅中心2 cm處，使用移液器分別接入1.0 μL Y2ΔbmyA和Y2。在28 ℃下培養(yǎng)5 d后，觀測平板上各芽孢桿菌的抑菌情況并拍照。每個菌株重復(fù)6次，每個重復(fù)1皿。獨立重復(fù)本試驗3次。

1.2.5 Y2-comK及其ΔbmyA突變體的綠色熒光蛋白標(biāo)記 利用誘導(dǎo)自然轉(zhuǎn)化法［20］向Y2-comK和Y2ΔbmyA導(dǎo)入綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pHAPII，具體步驟如下：挑取在含相應(yīng)抗生素的LB固體平板上生長的Y2-comK和Y2ΔbmyA單菌落，分別接種至含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，在37 ℃下以160 r/min振蕩過夜培養(yǎng)；按照1∶100的接種比例向GCHE培養(yǎng)基中接入上述細(xì)菌的LB過夜培養(yǎng)物，在37 ℃下以160 r/min振搖培養(yǎng)至OD600≈0.6；向GCHE培養(yǎng)基中加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，然后在室溫下以5000 r/min離心5 min；取適量的上清液懸浮菌體細(xì)胞沉淀，加入1 μg質(zhì)粒pHAPIIDNA，在37 ℃下以75~90 r/min振搖30 min；隨后添加適量體積的含亞致死濃度卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基，在37 ℃下以160 r/min培養(yǎng)1.5~2.0 h；取適量體積的培養(yǎng)物，均勻涂布于含卡那霉素的LB瓊脂平板，在37 ℃下倒扣培養(yǎng)，在光電折射儀下觀察抗性轉(zhuǎn)化子的熒光表現(xiàn)，分別命名為Y2-comK-gfpmut3a和Y2ΔbmyA-gfpmut3a。挑取發(fā)綠色熒光的抗性菌落，轉(zhuǎn)入含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基振搖培養(yǎng)，隨后加入等體積的無菌的40%（體積分?jǐn)?shù)）甘油，混勻后在-80 ℃下保存。

1.2.6 Y2ΔbmyA定殖玉米的動態(tài)測定 將玉米種子依次浸泡于1%（體積分?jǐn)?shù)）NaClO中30 s和75%（體積分?jǐn)?shù)）酒精中90 s，以作表面消毒處理，隨后用無菌水清洗3~4次。播種表面消毒過的玉米種子于裝有無菌育苗基質(zhì)的培養(yǎng)缽中，直至2片真葉長出。移栽玉米幼苗至預(yù)先裝有無菌土（300 g/盆）的盆缽中，每盆栽植3株，沿玉米幼苗根系周圍土壤澆灌Y2ΔbmyA-gfpmut3a或Y2-comK-gfpmut3a菌體細(xì)胞懸浮液（1×107cfu/mL），每盆澆灌50 mL。然后，將盆缽全部移入光周期為16 h光照/8 h黑暗的25 ℃（晝溫）/20 ℃（夜溫）的光照培養(yǎng)箱內(nèi)。仿照本實驗室前人的操作［21］，在接種后的第3、5、9及15天分別對玉米根系組織取樣（3盆/次）并研磨，取適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液涂布于含卡那霉素的LB固體平板，在37 ℃下培養(yǎng)，直至長出菌落。在光電折射儀下觀察并統(tǒng)計熒光菌落的數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Y2的ΔbmyA突變體的驗證

利用引物對bmyA-F/R對Y2的ΔbmyA基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示從突變體擴(kuò)增出的條帶長度明顯大于從Y2-comK中擴(kuò)得的條帶長度，超出1.2 kb左右（圖1），初步表明Y2體內(nèi)的bmyA基因被成功地破壞。此株突變體脂肽類粗提取物的LC-MS檢測分析結(jié)果如圖2所示，Y2野生型產(chǎn)桿菌霉素D的質(zhì)量峰在23.123 min和24.300 min這2個保留時間均檢測到m/z 1031.55、1045.56；相較于Y2野生型，突變體Y2ΔbmyA在上述相同保留時間沒有檢測到m/z 1031.55、1045.56這2個離子信號峰。上述結(jié)果進(jìn)一步表明bmyA被插入破壞，導(dǎo)致Bacillomycin D的生物合成在Y2的ΔbmyA對應(yīng)缺失。

圖1 突變體Y2ΔbmyA的PCR驗證結(jié)果

圖2 Y2-comK、Y2ΔbmyA產(chǎn)桿菌霉素 D 的ESI質(zhì)譜分析結(jié)果

2.2 Y2及Y2ΔbmyA生長曲線的比較

明確bmyA基因敲除后對菌株生長是否存在影響是后續(xù)研究的基礎(chǔ)。野生型菌株Y2與突變體Y2ΔbmyA生長曲線的比較結(jié)果如圖3所示，發(fā)現(xiàn)脂肽類物質(zhì)合成缺陷突變體與野生型并沒有存在顯著差異，生長趨勢基本一致，說明敲除bmyA基因并不影響菌株的生長。

圖3 Y2與突變體Y2ΔbmyA的生長曲線

2.3 Y2ΔbmyA對尖孢鐮刀菌的拮抗活性

通過室內(nèi)平板對峙培養(yǎng)實驗，觀測了桿菌霉素D合成缺陷突變體對尖孢鐮刀菌的拮抗活性，結(jié)果如圖4所示，相較于Y2野生型，在接種有Y2ΔbmyA的區(qū)域，尖孢鐮刀菌菌絲已經(jīng)與細(xì)菌菌落接觸并蔓延。野生型的抑菌圈直徑為（0.85±0.02）cm，突變體Y2ΔbmyA的抑菌圈直徑僅為（0.14±0.03）cm，表明桿菌霉素D的缺失導(dǎo)致突變體對尖孢鐮刀菌的拮抗能力下降。

圖4 Y2ΔbmyA對香蕉枯萎病菌的拮抗作用

2.4 Y2ΔbmyA在玉米植株及根際土中的定殖動態(tài)

從表3可以看出：在處理0~15 d后，在玉米根際土和根系組織中均分離獲得了Y2和Y2ΔbmyA；無論是在玉米根際土中還是在根系組織中，Y2-comK-gfpmut3a的定殖密度均顯著高于突變體Y2ΔbmyA。對菌株在玉米根際土中定殖量的檢測發(fā)現(xiàn)，在接種3 d后野生型菌株Y2的定殖量最大，達(dá)4.71×103cfu/g（鮮重）；而與野生型菌株相比，Y2ΔbmyA在根際土中的定殖量降低了42.25%。在根系組織中檢測發(fā)現(xiàn)，在接種5 d后野生型Y2的定殖密度達(dá)到最大值4.74×103cfu/g（鮮重）；與野生型菌株相比，Y2ΔbmyA在根系組織中的定殖量降低了16.88%。

表3 Y2和Y2ΔbmyA在玉米根際土及根系組織內(nèi)的定殖菌量 cfu/g（鮮重）

3 討論

作為一類重要的生防資源，芽孢桿菌可通過合成抗菌化合物抑制病原真菌來防控病害并促進(jìn)植物健康。目前報道的與芽孢桿菌生防活性緊密相關(guān)的抗菌化合物主要有幾丁質(zhì)酶、1，3-1，4-葡聚糖酶及脂肽類等。其中，脂肽類化合物如芬薺素、伊枯草菌素（含桿菌霉素D）和表面活性素家族被認(rèn)為是芽孢桿菌拮抗病原、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性以及促進(jìn)生物膜形成的關(guān)鍵因子。許多研究發(fā)現(xiàn)由芽孢桿菌分泌的脂肽類分子對包括蕓苔根腫菌（Plasmodiophora brassicae）［22］、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）［23］、灰霉病菌（Botrytis cinerea）［24］、蘋果環(huán)腐病菌（Botryosphaeria dothidea）［25］及鐮刀菌（Fusarium sp.）等［26］在內(nèi)的植物病原真菌具有很強(qiáng)的抑制活性，但關(guān)于各種脂肽類抗生素拮抗的病原真菌最佳對象的研究并不多。

本研究通過定點敲除以及后續(xù)驗證，成功地獲得了植物促生根際細(xì)菌——解淀粉芽孢桿菌B9 601-Y2的桿菌霉素D突變體。對峙培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示桿菌霉素D合成能力的缺失使突變體對香蕉枯萎病菌的抑制能力下降，表明桿菌霉素D可能是Y2抑制尖孢鐮刀菌的主要脂肽類物質(zhì)，這與前人的研究結(jié)果［17］一致。值得一提的是，脂肽類抗生素的另一個重要成員——表面活性素在Y2體內(nèi)先天缺失［27］，但筆者發(fā)現(xiàn)與其正常合成表面活性素的近緣解淀粉芽孢桿菌FZB42菌株相比，Y2對尖孢鐮刀菌的抑制活性與之相當(dāng)，暗示表面活性素可能并非芽孢桿菌拮抗尖孢鐮刀菌的唯一抗生素。前期也有報道［28］稱，貝萊斯芽孢桿菌SQR9的表面活性素參與對核盤菌、立枯絲核菌以及腐皮鐮刀菌的拮抗過程，未參與對尖孢鐮刀菌的抑制過程。這間接地印證了我們的推測。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在玉米根系組織內(nèi)部以及根際土壤中，Y2ΔbmyA的定殖密度均低于其野生型，表明桿菌霉素D的缺失的確影響到了Y2菌體在玉米根系組織及其相關(guān)環(huán)境中的定殖。但突變體Y2ΔbmyA是否通過破壞生物膜的形成來削弱菌體細(xì)胞的定殖能力，仍需要通過原位觀察等試驗來證實。