常倩倩，楊燁彰，李 睿，鄭浪漫,崔子龍，米熱妮薩·圖爾蓀托合提，陳鴻杰，劉春潔*，劉書東*

（1.塔里木大學 動物科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

綿羊是新石器時代人類馴化的最早家畜之一［1］。綿羊給人們的生活提供了大量的肉類、奶類、毛皮等產品。中國美利奴羊是我國第一個細毛羊品種，于1985年培育成功，它的父本是澳大利亞美利奴羊，母本是新疆細毛羊。該品種的適應性強、體型長，胸部寬且深，后肢肌肉豐滿，尾部寬而平直，頭部羊毛從頂部覆蓋至兩眼連線處，前肢羊毛覆蓋至腕關節(jié)處，后肢則羊毛覆蓋則達到腓關節(jié)；羊毛叢密度大、結構好，羊毛較長且有明顯的彎曲，毛色一般呈乳白色或者油白色，凈毛量較高，主要分布在新疆、內蒙古和東北地區(qū)等，所產羊毛長、產量高且質量好，羊毛的產量決定了羊毛產業(yè)的經濟效益，但羊的脫毛癥給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失。

羊脫毛癥是指羊的被毛脫落、根部萎縮、被毛發(fā)育不良等癥狀的總稱，是由于某種特殊病因，如缺乏營養(yǎng)和代謝紊亂、細菌感染、寄生蟲侵害、中毒等引起的一種非傳染性疾?。?］。在綿羊和山羊的群體中，脫毛癥是綿羊養(yǎng)殖過程中一種常見疾病，多見于泌乳期和妊娠后期的母羊［3］。羊脫毛癥在發(fā)病時，羊軀干和頸部的被毛會成片地脫落，被毛粗糙灰暗、無光澤，并呈現(xiàn)出不同程度的貧血，喜食雜物如黏土、污糞等。吃下去的雜物在胃內會形成毛球，繼而出現(xiàn)便秘、腹痛、消化不良等癥狀，嚴重者表現(xiàn)為消瘦貧血、腹瀉，個別羊出現(xiàn)視力模糊，甚至死亡。脫毛癥發(fā)病率可高達20%~35%，多為農業(yè)區(qū)和半農半牧區(qū)，死亡率通常較低，但會導致農牧民減產減收和經濟收入偏低。

目前，脫毛癥與基因的相關性主要在人類中的研究比較多，人類的斑禿（AA）是一種非瘢痕性的脫發(fā)，國外有研究稱斑禿疑似為自身免疫性疾病，AA的產生可能與異質表型相關［4］?；加蠥A的人一般會出現(xiàn)較嚴重的脫發(fā)，不同患者的脫發(fā)面積大小不盡相同。在脫發(fā)癥狀出現(xiàn)一段時間后，其病灶有的會出現(xiàn)不同程度的減小，甚至完全消退；有的則會逐漸擴大，延伸到整個頭皮。據研究稱，有大約2%的人會在一生當中的不同階段出現(xiàn)AA。AA很可能是由環(huán)境、免疫和遺傳因素共同引起的疾病，這一結論已經在多對同卵雙胞胎中得到驗證，并且獲得了多代AA成員家庭的認同［5］。

韓國慶熙大學生命科學學院東方藥物與加工系的一個研究小組稱，人參皂苷F2能夠通過2種生物學途徑控制細胞凋亡來降低脫發(fā)的發(fā)病率［6］。人參皂苷F2比魚肝素抑制毛細胞凋亡的效果更加顯著。他們的研究結果表明，人參皂苷F2降低了TGF-β2和SCAP蛋白的表達，這可能與細胞凋亡和進入卡他根有關。他們還發(fā)現(xiàn)DHT（二氫睪酮）可以通過減少生長因子TGF-β2來抑制毛發(fā)的生長，還能影響Smad-2基因的表達，這些因素以直接調控的方式影響毛細胞的凋亡［7］。

德國研究者表明，PTCH2基因可能被排除為脫 毛X型 的 致 病 因 素［8］。Lothrop和Schmeitzel提出，人類的CAH表型與狗的脫毛X表型具有一定的相似性。有90%~95%的人類CAH病例是由編碼類固醇21羥化酶的CYP21A2基因發(fā)生突變而引起的。歐洲一些藥物研究人員發(fā)現(xiàn)藥物抑制DGAT1可誘導小鼠和狗的皮脂腺發(fā)生萎縮，但卻只有小鼠出現(xiàn)明顯的脫發(fā)［9］，該研究組的結果表明，二酰甘油O-?；D移酶1（DGAT1）在合成脂類中具有非常重要的作用，但是DGAT1的抑制劑作為治療代謝性疾病和糖尿病的潛在藥物此前已有研究。在小鼠中，延長藥物抑制DGAT1和AZD7687的作用，可以與藥物抑制DGAT1小鼠產生相同的皮膚表型，包括皮脂腺萎縮和脫發(fā)。AZD7687對皮膚的介導有很強的時間依賴性，并且是可逆的，它們僅在持續(xù)的DGAT1抑制時發(fā)生；長期使用AZD7687對狗進行治療時也會致使皮脂腺發(fā)生萎縮，但不會導致更加嚴重的脫毛現(xiàn)象。盡管給人類使用的治療劑量和給小鼠使用的治療劑量對皮膚產生的影響可能有所不同，但在使用DGAT1抑制劑的臨床試驗中，監(jiān)測皮膚變化的工作依然十分重要。

綿羊脫毛癥主要受環(huán)境因素和基因因素共同影響，本研究主要從基因的因素分析脫毛癥的原因。在綿羊1號染色體上的遺傳信息量大，存在大量與皮膚、毛囊、生長發(fā)育相關的基因，具有經濟性狀相關的QTL有35個。因此，本論文選擇1號染色體作為研究對象，對其上的SNPs進行分析，獲得相關的分子標記。通過基因注釋找出脫毛癥有關的候選基因，在選擇選育中控制與減少脫毛癥的發(fā)病率，對預防和治療羊的脫毛癥具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在伊犁庫克圖拜種畜場，隨機挑選150只中國美利奴羊，分為病例組（50只）和健康組（100只）。樣品病理情況調查時間為2006~2016年。

1.2 耳組織采集

用剪耳鉗在耳緣處剪下一黃豆大小的組織塊，去除掉組織塊上的毛和雜物，置于已滅菌的1.5 mL離心管中，編號后放入采樣冰盒，送往實驗室，保存于-70 ℃的冰箱中備用。

1.3 樣品DNA提取

粉碎耳組織，加入2 mL裂解液，搖勻10 min；取出混合液冷卻至常溫，并向滅菌離心管加入600 μL Tris-HCl飽和酚溶液，將上下輕柔顛倒混勻10 min，于2000 r/min下離心10 min；用剪刀將1 mL槍頭尖部剪為直徑大小約0.3 cm的圓形，取出600 μL上清液移至新的滅菌離心管，加入1∶1的酚/氯仿溶液600 μL，輕柔搖勻5 min，于2000 r/min下離心10 min；將上層液移至新的滅菌離心管中，加入600 μL氯仿溶液，輕搖5 min后，于2000 r/min下離心10 min；加入冰無水乙醇1 mL，輕搖2 min，可觀察到的絮狀物即為DNA，于2000 r/min下離心10 min；將TE（pH值7.0）溶液加入滅菌離心管，彈起混勻干燥的DNA，保存于4 ℃冰箱中，直至DNA完全溶解。

1.4 送至生物公司制備芯片及其結果的處理

由生物公司進行Illumina Ovine SNP50 Bead-Chip制備，再由BeadScan Software軟件將圖像進行轉換，形成數據信號，然后再利用Genome Studio軟件對基本的數據結果進行處理，可以得到能用來運算的VCF文件，經過PLINK 1.07軟件將其轉換為MAP和PED文件。

1.5 基因型檢測

篩選生物技術公司提供的數據和SNP等位基因頻率分析，舍棄非目標SNPs位點。用PLINK 1.07軟件對其進行質量控制：排除樣品中檢出率低于95%的單體樣品。同時，排除質量不合格的SNPs，檢出率低于90%、最小等位基因頻率低于5%、哈代—溫伯格平衡檢驗P值低于1×10-6的SNPs。

1.6 Fst的計算

本研究中，根據無偏估計Fst方法計算留下的SNP位點，獲得2個群體的每個SNP位點的群體分化指數Fst值［10］。計算公式如下：

其中，MSG為檢測的群體內部位點的誤差均方：

MSP是檢測的群體之間位點的均方差：

nc為校正后的群體間平均樣本大?。?/p>

上述公式中，i是總亞群數S的一個群體，i=1，2，3，…，S；PAi是第i個亞群中SNP等位基因A的頻率； ni是亞群體i的平均樣本大小是各群體中PA的加權平均值，即

本研究的Fst數據計算基于（http：//www.r-project.org/）R語言pegas軟件包完成，畫圖基于R語言ggplot軟件包完成。

2 結果與分析

用分光光度計檢測所提取的耳組織DNA的濃度和純度，濃度大于50 ng/μL，純度OD260/OD280在1.7~2.0之間，OD260/OD230應介于1.8~2.1之間。用0.8%瓊脂糖凝膠，驗證所提取的耳組織基因組DNA。如圖1所示，瓊脂糖凝膠電泳檢測的條帶清晰帶型完整，點樣孔干凈、無污染、沒有拖尾現(xiàn)象?？梢哉f明所作電泳檢測的DNA沒有被蛋白質污染、未發(fā)生降解，其檢測質量合格，滿足高密度基因組芯片制備的條件。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

圖2中，橫軸代表26對常染色體，其圖中點的密度大小代表攜帶遺傳信息的多少；縱軸代表Fst值，其高度表示對應染色體上該位點表達的顯著程度。閾值線為研究參考線，閾值線上方區(qū)域為對研究有意義的位點，閾值線下方區(qū)域為舍棄位點。

圖2 健康和脫毛癥綿羊全基因組分化系數分析（Fst）曼哈頓圖及OAR1上Fst值分布情況

對健康組和病例組進行遺傳分化系數分析（表1），在1號染色體取前1%的分子標記35個，在這些分子標記附近的基因53個基因，其中有5個基因在基因組上沒有被注釋。其中影響皮膚發(fā)育的基因有GADD45A、MCCC1、MLPH、SSBP3等，已經有文獻報道SSBP3與脫毛癥相關（表2）。

表1 在2號染色體上健康和脫毛癥綿羊全基因組選擇信號分析（Fst≥0.251495）

表2 脫毛癥相關候選基因及其主要功能

3 討論

本論文通過對健康組和病例組進行選擇信號分析，通過生物軟件提取1號染色體，對其進行遺傳分化系數分析，獲取前1%的SNPs作為分子標記，經過基因注釋獲得相關基因53個，其中和皮膚毛囊發(fā)育相關的基因有4個，分別是GADD45A、GADD45A、MLPH、SSBP3，已報道與脫毛癥相關的基因是SSBP3。

GADD45A（Growth arrest and DNA damage inducible alpha）位于綿羊1號染色體45511896~45515027 bp范圍內，屬于GADD45A基因家族，是DNA損傷修復的重要基因，該基因是抵抗誘導紫外線照射腫瘤的關鍵基因，在細胞增殖上使GADD45A沉默，能通過p53信號通路。在小鼠上利用通過RT-qPCR測定mRNA的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)GADD45A沉默，使得腫瘤通過皮膚SCC中的p53信號通路促進了腫瘤細胞的增殖，并減少凋亡、衰老。而經過輻射引起的繼發(fā)性損傷的潛在機制可能有助于新型靶向藥物的開發(fā)，在一些文獻報道中，GADD45A是一個受輻射和光照在皮膚中上調的基因，GADD45A可能抑制上皮細胞的遷移和增殖。進一步信號通路分析表明，GADD45A過表達能抑制AKT（蛋白激酶B，PKB）及其P38和JNK磷酸化［11］。

MCCC1（Methylcrotonoyl-CoA carboxylase 1）位于綿羊1號染色體上222513107~222566511 bp之間，該基因編碼3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶的大亞基可以起到異二聚體的作用。這個基因發(fā)生突變可能與3-甲基巴豆酰甘氨酸尿癥有關，降低綿羊的免疫力，從而更多地引發(fā)疾病，該基因涉及糖酵解、TCA循環(huán)、OXPHOS、糖異生、β-氧化和支鏈脂肪酸代謝等，并且參與皮膚成纖維細胞抗氧化反應、破壞穩(wěn)態(tài)環(huán)境，這些都已通過線粒體功能分析得到了證實［12］。

黑素親和素MLPH（Melanophilin）位于綿羊一號染色體上范圍在3540879~3587459 bp之間。家畜不同的被毛顏色與黑色素沉著的種類和數量有關系，黑色素的生產決定被毛顏色的深淺程度。MLPH會影響黑素小體的轉運過程，使得家畜毛色發(fā)生改變，MLPH基因能使家畜毛色素稀釋，從而改變毛色［13］。

有些狗的皮毛顏色較淺，例如銀灰色、沙色、棕色等。這些不同的毛色會隨著色素基因表達而被稀釋，最后會出現(xiàn)脫發(fā)和皮膚炎癥，形成顏色稀釋脫發(fā)癥（CDA）［14］。CDA是以逐漸脫發(fā)為特征，反復被細菌感染次級毛囊形成毛囊炎。黑素體聚集在表皮和毛囊的黑素細胞內，導致毛發(fā)中的大黑素體和皮膚出現(xiàn)明顯的干燥［15］。

SSBP3（Single Stranded DNA Binding Protein 3）位于綿羊一號染色體上范圍在30346126~30511575 bp之間。該基因在角質形成細胞分化中具有重要作用，角質形成細胞中的SSBP3過度表達會導致表皮分化相關基因的活性顯著增加。SSBP3在角質形成細胞分化中具有重要作用。角質形成細胞中的SSBP3過表達會顯著增加與表皮分化有關基因的表達程度和活性；相反，SSBP3的低表達會降低表皮分化有關基因的表達程度和活性。此外，銀屑病和特應性皮炎是由表皮分化和皮膚脫水引起的皮膚病，在基因上表現(xiàn)為SSBP3的表達水平下降。這些結果表明，SSBP3可能通過積極調節(jié)角質形成細胞分化的方式與個體的水合皮膚表型相關聯(lián)［16］。

由于SSBP3的表達程度會影響與表皮分化有關基因的表達程度和活性，受影響的基因會在一定程度上影響表皮分化，推測可能使毛囊的形成與發(fā)育受到抑制，從而導致脫毛。此外，銀屑病和特應性皮炎是由表皮分化和皮膚脫水引起的皮膚病，在基因上表現(xiàn)為SSBP3的表達程度下降。而近年有報道稱銀屑病會伴發(fā)瘢痕性脫發(fā)［17］，據此認為SSBP3的低表達可能會引起脫毛癥。故將SSBP3列為羊脫毛癥的候選基因。

4 結論

通過遺傳分化系數（Fst）分析，在OAR1中獲得分子標記35個，在這些分子標記附近的53個基因，其中有5個基因在基因組上沒有被注釋。其中影響皮膚發(fā)育的基因有GADD45A、MCCC1、MLPH、SSBP3等，已經有文獻報道SSBP3與脫毛癥相關。對獲得的分子標記可以為綿羊分子選育提供參考，可以縮短世代間隔和育種年限、節(jié)約成本，最終獲得免疫力強的健康綿羊，防止綿羊脫毛癥的出現(xiàn)，從而減少農牧民的經濟損失。