張 莉，尹德鳳，向建軍，袁麗娟，廖且根，張大文*，羅林廣

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標準研究所，江西 南昌 330200；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（南昌），江西 南昌 330200；3.江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，江西 南昌 330200）

由水體富營養(yǎng)化引起的藍藻水華問題已經(jīng)成為世界性的水環(huán)境問題，其產(chǎn)生的異味物質(zhì)嚴重影響了飲用水源以及旅游水源的水質(zhì)，而且由此產(chǎn)生的各種生物毒素還會危害水生動物、鳥類甚至人類的健康［1-3］。大量打撈堆積的水華藍藻如果得不到及時有效的處理，對環(huán)境會造成嚴重的二次污染。水華藍藻中蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸總量可達52.63%，其中畜禽必需的氨基酸總量達30.25%［4］，如能有效合理利用，將成為資源短缺型動物蛋白的替代蛋白源［5］。為了了解家禽對水華藍藻粉中藻毒素的耐受和響應，開發(fā)水華藍藻在禽類飼料蛋白中的利用潛力，本實驗室前期開展了日糧中添加藍藻粉對崇仁麻雞生長性能的影響［6］，并對肝臟和腎臟組織的病理毒理作用進行了研究［7-8］，結果表明，不同藍藻粉替代量對雞只肝臟和腎臟造成的損害程度不一樣，替代劑量較低的10%和20%對雞只的生長性能沒有顯著影響。有研究顯示，雞只腸道微生物與其生長性能之間存在顯著的相關性影響［9］，動物腸道中的益生菌會通過競爭來抑制微囊藻毒素對動物機體的負面影響［10］，腸道微生物對宿主的健康起著非常重要的作用，對進入腸道的各種物質(zhì)代謝起著關鍵作用［11］，因此，推測本實驗室小劑量藍藻粉的攝入對雞只生長不產(chǎn)生顯著影響，可能與雞只腸道微生物的調(diào)節(jié)作用有關。當一定量的藍藻粉替代豆粕后，雞只腸道微生物菌群能否存在相應的響應機制？能否提升雞只對藍藻粉中藍藻毒素等危害因子的抵抗能力？本研究通過研究藍藻粉部分替代日糧中的豆粕后對家禽腸道微生物的影響，有助于了解家禽對藍藻毒素的抵御機制，為藍藻飼料化利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

34日齡健康雜交崇仁麻雞（快大型），在20日齡時開始進行適應性飼養(yǎng)2周，由江西國華禽業(yè)提供。

1.2 試驗材料

藍藻粉，來自無錫太湖，粗蛋白含量41.5%（實測），與基礎日糧中的豆粕蛋白質(zhì)含量（40.8%）相當。

1.3 試驗分組

試驗分組與王揚等［6］的研究一致，1組為對照組（CB），飼喂基礎日糧；2~4組分別用10%（CL）、20%（CM）、50%（CH）藍藻粉替代基礎日糧中的豆粕，試驗時間為35 d。各實驗組日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平

1.4 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)管理與王揚等［6］的研究一致，試驗雞飼養(yǎng)于同一雞舍內(nèi)，采用多層籠養(yǎng)，限飼，上午和下午各飼喂1次，每只雞每天的日糧攝入量為100 g，自由飲水。試驗前雞舍進行充分沖洗和嚴格消毒，按常規(guī)方法進行飼養(yǎng)管理，為防止免疫過程中對雞體內(nèi)生理生化指標的影響而干擾試驗結果，在試驗開始之后試驗雞只未進行免疫。

1.5 盲腸內(nèi)容物采集

飼喂結束后，每組隨機選取10只雞，將雞只實施安樂死后，拔毛清洗，無菌冷卻水沖洗后轉(zhuǎn)移至潔凈室取出盲腸，超凈工作臺中無菌操作收集盲腸內(nèi)容物，充分混勻后裝入離心管中，立即置于-80 ℃冰箱保存。

1.6 DNA提取及MiSeq測序

盲腸內(nèi)容物樣品DNA提取按照TIANGEN磁珠法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒（DP712-01）說明書進行。細菌16S rDNA V3-V4擴增引物為338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。PCR反應體系為：4 μL 5×FastPfu Buffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL Forward Primer（5 μmol/L）、0.8 μL Reverse Primer（5 μmol/L）、0.4 μL FastPfu Polymerase、0.2 μL BSA、10 ng Template DNA，補dd H2O 至20 μL。反應參數(shù)：① 95 ℃預變性3 min；②27次循環(huán)（95℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s）；③ 72℃延伸10 min，10 ℃保持。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，大小正確，條帶清晰可見的目標條帶用于進行后續(xù)測序試驗，MiSeq測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供的免費在線數(shù)據(jù)分析平臺——I-Sanger對數(shù)據(jù)進行分析（www.i-sanger.com）。

1.7.1 稀釋曲線繪制方法 選擇97%相似度的OTU或其他分類學水平，利用mothur計算不同隨機抽樣下的Alpha多樣性指數(shù)，利用R語言工具制作曲線圖。

1071 Value of contrast-enhanced ultrasound in differential diagnosis of pleural-based pulmonary tuberculosis and lung cancer

1.7.2 Chao1指數(shù)的計算公式

式（1）中，Schaol=估計的OTU數(shù)；Sobs=實際觀測到的OTU數(shù)；nl=只含有1條序列的OTU數(shù)目；n2=只含有2條序列的OTU數(shù)目。

1.7.3 Coverage指數(shù)的計算公式

式（2）中，nl=只含有1條序列的OTU數(shù)目；N=抽樣中出現(xiàn)的總序列數(shù)目。

1.7.4 Simpson指數(shù)的計算公式

式（3）中，Sobs=實際觀測到的OTU數(shù)；ni=第i個OTU所含的序列數(shù)；N=所有的序列數(shù)。

1.7.5 PCA分析方法 采用R語言進行PCA統(tǒng)計分析，基于分析結果，將不同分組樣本在第一主成分軸上做箱線圖，直觀呈現(xiàn)出不同分組樣本在第一主成分軸上的差異離散情況。

1.7.6 物種群落結構分析 利用R語言工具統(tǒng)計和作圖。

2 結果與分析

2.1 日糧中添加藍藻粉對崇仁麻雞生長性能的影響

在整個實驗期，各組雞只攝食情況沒有差異，各組均無病雞、死雞現(xiàn)象出現(xiàn)，飼養(yǎng)結束后，各組雞只生長情況見表2。

表2 崇仁麻雞生長性能測定結果

2.2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

不同試驗組樣本的序列信息見表3，經(jīng)拼接、過濾等數(shù)據(jù)前處理，4個試驗組的樣本一共得到206403條序列，平均長度438.94 bp。按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行運算分類單元（OTU）聚類，得到OTU總數(shù)為395個。

表3 樣本序列信息統(tǒng)計表

2.3 稀釋曲線分析

稀釋曲線分析可以驗證取樣數(shù)量的合理性，如圖1所示。4個試驗組的樣本的稀釋曲線均已趨向平坦，說明試驗取樣數(shù)量合理，測序深度已基本覆蓋樣本中所有細菌。

圖1 稀釋曲線圖

2.4 Alpha多樣性分析

盲腸內(nèi)容物細菌Alpha多樣性結果采用豐富度指數(shù)chao1值、物種覆蓋度（coverage）和辛普森多樣性指數(shù)（Simpson指數(shù)）進行表示，如表4所示。各組樣本中物種覆蓋度均為0.999，說明所有樣本中所含序列均被成功測序，本次測序可以反映樣本中細菌群落結構的真實情況。對照組樣本（CB）的細菌豐富度指數(shù)Chao1值小于各藍藻組，Simpson指數(shù)值大于各藍藻組。

表4 樣本表面Alpha多樣性指數(shù)分析

2.5 β多樣性分析

如圖2所示，在屬水平對樣本的測序數(shù)據(jù)進行樣本層級聚類分析（A）和PCA分析（B）中，根據(jù)不同樣品之間的相對距離可以看出，隨著藍藻粉替代比例的增加，與對照組盲腸內(nèi)容物的beta多樣性差異逐漸增大。

圖2 樣品的β多樣性分析

2.6 物種群落結構特征分析

本次試驗共獲得13個門，113個屬，395個OTU。在門水平上，有12個門為各樣品組共有，p_Spirochaetae僅在CM組和CH組樣本中存在（表5）。在屬水平上有100個屬為各樣品組共有，3個屬為3個藍藻替代組共有而對照組中未出現(xiàn)，2個屬僅在CM組和CH組中出現(xiàn)，1個屬僅在CH組和CL組中獲得，1個屬僅在CH組和CB組中獲得。在OTU水平上，實驗組和對照組共有OTU數(shù)量291個，3個藍藻粉替代組特有OTU數(shù)量58個，CL組特有OTU數(shù)量為4個，CM組特有OTU數(shù)量為2個，CH組特有OTU數(shù)量為10個（表5）。

表5 各樣本物種在門、屬和OTU水平上的Venn數(shù)據(jù)表

各組樣本盲腸內(nèi)容物中細菌群落結構特征如圖3所示。在門水平上（圖3A），各試驗組樣本中的微生物豐度最大的均是擬桿菌門和厚壁菌門，其次是變形菌門和互養(yǎng)菌門。各試驗組樣本中擬桿菌門數(shù)量較對照組均有所下降，其中CH組中擬桿菌門數(shù)量下降明顯；厚壁菌門數(shù)量在CL組和CM組有所上升，在CH組上升趨勢不明顯；變形菌門數(shù)量在CL組中呈下降趨勢，在CM組和CH組有比較明顯的上升趨勢；互養(yǎng)菌門在CM組下降明顯，而在CL組和CH組上升明顯，特別是CH組，其互養(yǎng)菌門所占比例是CB組所占比例的2.5倍；疣微菌門數(shù)量在CL組和CM組中比例明顯下降。在屬水平上（圖3B），各試驗組樣本中的擬桿菌屬豐度最大，其次是互養(yǎng)菌屬、乳桿菌屬、Rikenellaceae_RC9_gut_group、［Ruminococcus］_torques_group、脫硫弧菌屬等。擬桿菌屬所占比例在CM組和CH組有所下降；互養(yǎng)菌屬在CM組中所占比例下降明顯，而在CL組和CH組中所占比例升高明顯；脫硫弧菌屬在CL組中所占比例下降明顯，隨著替代劑量的升高，所占比例又不斷升高，到CH組已顯著高于CB組含量；Rikenellaceae_RC9_gut_group在對照組中未發(fā)現(xiàn)，但在藍藻粉替代組中卻被檢出，且所占比例隨著藍藻粉添加量的增加而增大。乳桿菌屬在藍藻粉替代組中所占比例均比對照組高，其中CL組最高，為CB組的2倍；普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）的Prevotellaceae_UCG-001屬細菌的數(shù)量在CL組和CM組中所占比例顯著下降，而CH組與CB組相比而言變化并不明顯，Unclassified_f_Prebotellaceae的數(shù)量在CL組和CM組中未被發(fā)現(xiàn)，而在CH組中所占比例卻超過對照組的2倍之多；Akkermansia細菌僅出現(xiàn)在CH組中。

圖3 各組盲腸內(nèi)容物中細菌群落在門（A）和屬（B）水平上的分布

2.7 物種組間差異顯著性檢驗

各藍藻添加組中擬桿菌門、變形菌門、互養(yǎng)菌門和疣微菌門均與對照組呈現(xiàn)顯著性差異，厚壁菌門在CL組和CM組中與CB組呈顯著性差異，而在CH組中與CB組差異不顯著（圖4）。在屬水平上，各添加組中擬桿菌屬、互養(yǎng)菌屬、乳桿菌屬、脫硫弧菌屬等均與對照組呈現(xiàn)顯著性差異（圖5）。

圖4 門水平上基于費舍爾精確檢驗的兩樣本比較

圖5 屬水平上基于費舍爾精確檢驗的兩樣本比較

3 討論

雞只腸道微生物菌群在營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、免疫調(diào)節(jié)以及有毒有害物質(zhì)的分解等方面發(fā)揮著巨大的作用［12］，其多樣性在孵化早期隨著日齡的增長而不斷發(fā)生變化，之后逐漸趨于穩(wěn)定［13-14］，腸道內(nèi)正常的土著菌群主要為厚壁菌門和擬桿菌門［12］，其數(shù)量和多樣性結構受多種因素的影響，年齡、飼料結構、環(huán)境外源物的攝入以及病原微生物的感染等均對雞只腸道微生物多樣性產(chǎn)生顯著影響［15-16］。

本研究在雞只日糧中添加不同比例的藍藻粉替代豆粕后，雞只腸道中微生物菌群結構與對照組之間存在顯著差異。在門水平上，與CB組相比，CL組和CM組雞只腸道中的厚壁菌門數(shù)量有所上升，擬桿菌門有所下降；而CH組擬桿菌門數(shù)量下降顯著，厚壁菌門無明顯變化，但變形菌門上升顯著；CL組變形菌門數(shù)量呈下降趨勢，CM組呈上升趨勢。在屬水平上，藍藻粉替代組中乳桿菌屬數(shù)量均高于對照組，特別是CL組樣本中乳桿菌豐度超過對照組豐度近2倍；而脫硫弧菌豐度在CL組較CB組明顯降低，隨著替代劑量的增加，其豐度又逐漸變大，至CH組超過CB組近1倍。在CH組雞只盲腸中檢測到豐度較高的Akkermansia屬細菌，而其他組并未檢測到該類細菌。

已有研究表明，在動物消化道中的擬桿菌門和厚壁菌門細菌對多種物質(zhì)的代謝都非常重要，且擬桿菌門和厚壁菌門細菌數(shù)量的變化直接關系到動物體從飼糧中獲取能量的效率，增加厚壁菌門數(shù)量，降低擬桿菌門數(shù)量，使擬桿菌門/厚壁菌門的比值降低，可對動物生長起促進作用［17］；而變形菌門中包含許多致病微生物，如致病性大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌等，在一定條件下常常引發(fā)動物的各種胃腸道炎癥性疾病，影響其免疫力和生長速度，因此，降低變形菌門數(shù)量有利于保持動物腸道健康［18］。在屬水平上，乳桿菌在腸道中的存在可降低大腸桿菌及沙門氏菌等致病菌在腸道壁的強黏附能力，增強動物機體的免疫力［19］，脫硫弧菌數(shù)量與腸道息肉和潰瘍性結腸炎密切相關［20］。而Akkermansia屬細菌由于能利用黏液中的黏蛋白作為唯一碳氮源，且通常與包括IBD、克羅恩病、潰瘍性結腸炎和闌尾炎在內(nèi)的幾種腸道疾病相關［21］。由此可知，低劑量藍藻粉替代組中，雞只可通過增加體內(nèi)腸道中有益菌的數(shù)量來競爭抑制藍藻粉中藍藻毒素等有害物質(zhì)對機體的毒害，一旦替代量過高，則會增加藍藻粉中藍藻毒素等有害成分對雞只的毒性效應，影響了雞只健康，這一結果正好解釋了前期的研究結果，藍藻粉替代豆粕的CL組和CM組的雞只生長均未受到顯著影響，但CH組雞只生長受到顯著性的影響［6］。

綜合上述，適量（≤10%）藍藻粉替代豆粕對寧都黃雞生長不產(chǎn)生影響；當藍藻替代量繼續(xù)增加后，其中的藻毒素（MCs）等有毒有害物質(zhì)的毒性效應逐漸凸顯，最終導致雞只生長受限。因此，要使藍藻粉規(guī)?；剡M行禽類飼料化應用，必須進行藻毒素等有毒有害物質(zhì)的脫毒處理或嘗試進行添加外源益生菌對藻毒素等有毒有害物質(zhì)的負面作用進行抑制。