龍亞飛，唐佳代，王 帥，呂相華，吳德光，2

（1.茅臺學(xué)院釀酒工程系，貴州仁懷 564500；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300000）

醬香型白酒具有醬香突出，香氣優(yōu)雅細(xì)膩，口味醇厚，回味悠長，空杯留香持久的獨(dú)特風(fēng)格。醬香酒的特征在一定程度上是由其獨(dú)特的生產(chǎn)工藝（即高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫流酒和生產(chǎn)周期長、貯存期長）、氣候和微生物多樣性決定的。其中，高溫堆積是醬香型白酒特有的釀造工藝，大量釀造環(huán)境中的微生物在此過程中富集，為窖池發(fā)酵提供了大量的微生物儲備、酶類資源和香味物質(zhì)及其前體物質(zhì)。近年來，“醬酒熱”仍在持續(xù)，2020 年，以貴州茅臺酒為代表的醬香型白酒凈利潤約為455 億元，利潤率達(dá)到46.38%?？勰覐?fù)膜酵母（），又稱擬內(nèi)孢霉，是子囊菌門（Ascomycota）酵母亞門(Saccharomycotina)下酵母綱(Saccharomycetes)酵母目(Saccharomycetales)酵母科(Saccharomycetace)復(fù)膜酵母屬()的一個(gè)種。該菌株是多種酒曲和酒醅中的主要酵母之一，產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶，所產(chǎn)的酶都具有較高的活性，在釀酒工業(yè)中，這些酶活性決定了扣囊復(fù)膜酵母能夠以各種原料為底物，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酒精。不少研究發(fā)現(xiàn)扣囊復(fù)膜酵母能產(chǎn)香產(chǎn)酯并利用丟糟生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白飼料。白酒糟是釀酒行業(yè)最大的副產(chǎn)物，產(chǎn)量巨大且營養(yǎng)豐富，是一種很好的生物質(zhì)資源，白酒酒糟中還含有一些殘余淀粉。因此，研究醬香堆積酒醅中扣囊復(fù)膜酵母及該菌利用酒糟酒醅混合液發(fā)酵產(chǎn)酒精能力十分有價(jià)值。

本研究采用平板分離篩選醬香堆積酒醅中的扣囊復(fù)膜酵母菌，并通過分子生物學(xué)法對其進(jìn)行鑒定，探索該菌種利用酒糟及酒醅混合液產(chǎn)酒精的最佳工藝條件，為該菌種的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 酒醅及酒糟

酒醅取自貴州省仁懷市紅土地釀酒作坊第三輪次堆積酒醅；酒糟取自貴州茅臺酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂、乙醇、D（+）-麥芽糖、硫酸鎂·7HO，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；可溶性淀粉、葡萄糖、α-乳糖、磷酸二氫鉀，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蔗糖、硫酸銨、氯化鈣·HO、氯化鈉，成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD 培養(yǎng)基：每1000 mL 中，酵母浸膏10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，瓊脂20 g，pH值自然。

1.1.4 儀器設(shè)備

本研究用到的儀器及設(shè)備見表1。

表1 儀器設(shè)備及規(guī)格

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 扣囊復(fù)膜酵母的分離鑒定

（1）分離純化

稱取醬香型堆積酒醅1.0 g，加入到99 mL 帶玻璃珠的無菌水中，搖床振蕩5 min 進(jìn)行10 倍系列稀釋（10、10、10、10、10、10、10、10）。各取1 μL 稀釋液涂布于YPD 平板上進(jìn)行涂布分離，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d 后挑取形態(tài)不同的單菌落，多次在YPD 平板上劃線純化，獲得純培養(yǎng)的菌株。

（2）形態(tài)學(xué)鑒定

將純化獲得的扣囊復(fù)膜酵母接入YPD 固體培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d，觀察其菌落形態(tài)；將純化獲得的扣囊復(fù)膜酵母接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在12 h、24 h、36 h、48 h 時(shí)分別取樣，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

（3）分子鑒定

菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)鑒定后獲得的酵母菌株，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，以NL1和NL4 為上下游引物，擴(kuò)增26S rDNA 目標(biāo)基因?qū)赀M(jìn)行分子鑒定。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對分析。

1.2.2 單因素發(fā)酵條件對酒精產(chǎn)量的影響研究

為探究發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、菌株接種量及酒糟與酒醅比在扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵過程中對酒精產(chǎn)量的影響，將篩選出的扣囊復(fù)膜酵母菌株（S-9）按照不同發(fā)酵條件（發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、菌株接種量）接種于不同比例的酒糟、糟醅混合液中，通過測量酒精的產(chǎn)量來確定各個(gè)單因素的最佳條件。酒精含量測定方法采用氣相色譜法：美國安捷倫科技有限公司，色譜柱：CP-Wax57CB(50 m×0.25 mm×0.2 μm)聚乙二醇石英毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度240 ℃；檢測器溫度280 ℃；進(jìn)樣量1 μL；載氣流量1.0 mL/min；分流比15∶1；氫氣（H）∶空氣（O）∶尾吹氣（N）=400∶40∶25。升溫程序：初溫40 ℃，保持5 min；以5 ℃/min 升至110 ℃，以20 ℃/min 升至280 ℃，保持30 min。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取菌種接種量、溫度、時(shí)間、糟醅比4 個(gè)因素，進(jìn)行4 因素3 水平正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步考察各因素對酒精產(chǎn)量的影響，正交條件如表2所示。

表2 扣囊復(fù)膜酵母產(chǎn)酒精四因素三水平正交條件表

2 結(jié)果與分析

2.1 分離鑒定

利用YPD 作為培養(yǎng)基對扣囊復(fù)膜酵母進(jìn)行菌株篩選，在平板上28 ℃培養(yǎng)2 d，經(jīng)菌落形態(tài)以及菌株鏡檢觀察，共篩選分離到9 株（分別命名為S-1、S-2、S-3、S-4、S-5、S-6、S-7、S-8、S-9）具有酵母特征的菌株（見圖1、圖2）。

圖1 酵母菌初篩

圖2 扣囊復(fù)膜酵母的菌落和細(xì)胞形態(tài)特征

在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，本研究對篩選出的9株菌進(jìn)行分子水平鑒定，PCR 產(chǎn)物測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast 同源性比對，比對結(jié)果見表3，確定5株為扣囊復(fù)膜酵母。

表3 酵母菌株26S rDNA鑒定結(jié)果

2.2 單因素發(fā)酵條件對扣囊復(fù)膜酵母酒精產(chǎn)量的影響

本研究選取4 個(gè)因素，包括菌株接種量（10～10個(gè)/mL）、發(fā)酵溫度（24～32 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（24～120 h）、糟醅比（1∶1～1∶5），對篩選到的S-9 菌株發(fā)酵產(chǎn)酒精條件做了進(jìn)一步研究。菌株的接種量是影響酒精產(chǎn)量的重要因素之一，如圖3A 所示，當(dāng)扣囊復(fù)膜酵母的接種量為10個(gè)/mL 時(shí)，菌株的酒精產(chǎn)量最高，達(dá)到2480 ng/μL。在考察發(fā)酵溫度對酵母菌產(chǎn)酒精能力的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)（見圖3B），菌株S-9的酒精產(chǎn)量隨著溫度升高先上升、后降低，這可能與扣囊復(fù)膜酵母最適生長溫度有關(guān)，溫度偏高或偏低對菌株的發(fā)酵產(chǎn)酒精均有明顯的抑制作用，在28 ℃時(shí)產(chǎn)量最高，達(dá)到3594 ng/μL。發(fā)酵時(shí)間不同程度上影響著扣囊復(fù)膜酵母菌株的酒精產(chǎn)量，如圖3C 所示，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為96 h 時(shí)，S-9 菌株酒精產(chǎn)量達(dá)到最高值，為2738 ng/μL，隨著發(fā)酵時(shí)間延長可能酒精揮發(fā)了，導(dǎo)致酒精產(chǎn)量降低。糟醅比對扣囊復(fù)膜酵母產(chǎn)酒精影響比較大（圖3D），這可能與糟醅混合液中淀粉成分的含量有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，隨著酒醅添加量的增加，酒精產(chǎn)量先增加后減少，可能是扣囊復(fù)膜酵母接種量不夠，糟醅比1∶3是最適合的底物配比，酒精產(chǎn)量高達(dá)3455 ng/μL。

圖3 單因素發(fā)酵條件對扣囊復(fù)膜酵母菌株酒精產(chǎn)量的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取4 個(gè)因素各3 個(gè)水平進(jìn)行菌株產(chǎn)酒精能力研究，包括A 菌株接種量（10個(gè)/mL、10個(gè)/mL、10個(gè)/mL）、B 發(fā) 酵 溫 度（26 ℃、28 ℃、30 ℃）、C發(fā)酵時(shí)間（72 h、96 h、120 h）、D 糟醅比（1∶2、1∶3、1∶4）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以確定菌株S-9 產(chǎn)酒精的最優(yōu)發(fā)酵條件，正交表見表2。菌株S-9 的產(chǎn)酒精條件結(jié)果和極差分析見表4，結(jié)果表明，4 個(gè)影響因素中糟醅比對酒精的產(chǎn)量影響程度最大，4 個(gè)因素的影響程度由高到低排序?yàn)樵沲龋景l(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞菌株接種量。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析，最優(yōu)組合為ABCD，即接種量為10個(gè)/mL，發(fā)酵溫度為26 ℃，發(fā)酵時(shí)間為72 h，糟醅比為1∶2，此條件下酒精的產(chǎn)量為3672 ng/μL。

表4 S-9菌株產(chǎn)酒精條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究通過菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)分析從醬香堆積酒醅中分離出9 株酵母菌，經(jīng)分子鑒定，確定5株為扣囊復(fù)膜酵母。對其中1 株進(jìn)行酒精發(fā)酵研究，單因素實(shí)驗(yàn)最佳條件為：發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間96 h，接種扣囊復(fù)膜酵母量10個(gè)/mL，最佳糟醅比1∶3。正交實(shí)驗(yàn)的最佳組合為ABCD，即接種量為10個(gè)/mL，發(fā)酵溫度為26 ℃，發(fā)酵時(shí)間為72 h，糟醅比為1∶2。為進(jìn)一步研究扣囊復(fù)膜酵母在醬香白酒生產(chǎn)及白酒糟回收利用中的應(yīng)用提供參考。