郭光鑫　孫穎　欒海鵬　管東輝

摘要 目的：使用中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探討透膿散治療慢性骨髓炎的潛在作用機(jī)制。方法：通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)搜索透膿散中黃芪、當(dāng)歸、川芎、皂角刺中所含有的化合物（因目前國(guó)家對(duì)于穿山甲稀有動(dòng)物的保護(hù)，為響應(yīng)國(guó)家號(hào)召，未進(jìn)行穿山甲化合物的采集），篩選出透膿散中藥物的符合要求的活性成分及作用靶點(diǎn);通過(guò)人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards）搜索慢性骨髓炎的靶點(diǎn)信息;使用Cytoscape分析軟件進(jìn)行“藥物-化合物-靶點(diǎn)”分析，導(dǎo)入功能蛋白聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（STRING）行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的分析，之后使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Gene ID轉(zhuǎn)換，差異基因的功能、通路富集分析等。結(jié)果：篩選后共獲得透膿散治療慢性骨髓炎的431個(gè)相關(guān)成分和227個(gè)靶點(diǎn)信息;慢性骨髓炎的相關(guān)靶點(diǎn)信息438個(gè);PPI網(wǎng)絡(luò)46個(gè)核心蛋白，關(guān)鍵涉及白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-6、MMP9、TP53等;獲得GO生物過(guò)程368條，主要涉及細(xì)胞增殖、免疫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡;KEGG信號(hào)通路88條，涉及破骨細(xì)胞分化、瘧疾、甲型流感、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、核因子κB以及TNF信號(hào)通路。結(jié)論：透膿散可能通過(guò)控制細(xì)胞凋亡、免疫炎癥反應(yīng)等途徑對(duì)慢性骨髓炎發(fā)揮治療作用，通過(guò)分析為透膿散治療慢性骨髓炎提供微觀層面的理論信息支持。

關(guān)鍵詞 透膿散;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);慢性骨髓炎;信號(hào)通路;作用機(jī)制

Exploration of Molecular Action Mechanism of Tounong Powder in the Treatment

of Chronic Osteomyelitis Based on Pharmacy Network

GUO Guangxin，SUN Ying，LUAN Haipeng，GUAN Donghui

（1 The First Clinical Medical College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China; 2 School of

Traditional Chinese Medicine，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China; 3 Affiliated Hospital

of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China）

Abstract Objective：To explore the potential action mechanism of Touyu Powder in the treatment of chronic osteomyelitis by using Chinese herbal compound network pharmacology technology.Methods：Through the database of the Laboratory of Computational Systems Biology（TCMSP），we searched for compounds contained in Astragalus，Angelica，Ligusticum chuanxiong and Saponaria japonicus in Toupu Powder（Due to the current national protection of rare pangolin animals，in response to the call of the country，no collection of pangolin compounds has been carried out）.We screened out the active ingredients and target of action of the drugs in Touyu Powder; we searched for the target information of chronic osteomyelitis through the human gene database（GeneCards）; used Cytoscape analysis software to perform “drug-compound-target” analysis，imported the functional protein connection network database（STRING） to analyze the protein interaction network，and then used the DAVID database for Gene ID conversion，differential gene function，pathway enrichment analysis，etc.Results：After screening，a total of 431 related components and 227 target information for the treatment of chronic osteomyelitis by Touyu Powder were obtained; related target information for chronic osteomyelitis was 438; there were 46 core proteins of protein interaction network.The key was related to interleukin 10，interleukin 6，and interleukin 6 MMP9，TP53，etc.; we obtained 368 GO biological processes，mainly related to cell proliferation，immunity，inflammation，apoptosis; there were 88 KEGG signaling pathways，related to osteoclast differentiation，malaria，influenza A，rheumatoid arthritis，NF-kB and TNF signaling pathway.Conclusion：Touyu Powder may have a therapeutic effect on chronic osteomyelitis by controlling cell apoptosis and immune inflammatory response.The analysis of this paper provides microscopic theoretical information support for the treatment of chronic osteomyelitis with Touyu Powder.

Keywords Touyu Powder; Network pharmacology; Chronic osteomyelitis; Signaling pathway; Mechanism action

中圖分類(lèi)號(hào)：R289.5;R274.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.004

慢性骨髓炎是一種骨的慢性感染性疾病，多見(jiàn)于骨折手術(shù)之后、糖尿病控制不佳的嚴(yán)重并發(fā)癥、血源性骨感染等。其可見(jiàn)反復(fù)發(fā)作病史、非特異性疼痛、皮膚色素沉著、顏色異常、健側(cè)患側(cè)不對(duì)稱(chēng)性腫脹，有的甚至可能會(huì)出現(xiàn)竇道[1]。臨床上的慢性骨髓炎并不少見(jiàn)，盡管隨著外科手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步以及抗生素治療水平的逐漸提高，骨髓炎的治療較之前有很大提高，但是隨著臨床上抗生素的大量使用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等一些耐藥菌，依然是令骨科醫(yī)生頭疼的問(wèn)題。目前的骨髓炎的手術(shù)治療多采用的是感染骨段切除加骨搬運(yùn)以及各種帶萬(wàn)古霉素植入術(shù)，且一般需長(zhǎng)期使用抗生素，對(duì)于肝腎損害很大，會(huì)出現(xiàn)耳毒癥、消化道反應(yīng)、免疫變態(tài)反應(yīng)、“紅人綜合征”以及血液成分異常等不良反應(yīng)[2]。慢性骨髓炎在中醫(yī)學(xué)中稱(chēng)為“附骨疽”，多由于患者在感受疔瘡癤癰等毒、麻疹、傷寒等疾之后，余毒未清，伏結(jié)于內(nèi)，久而入骨成疽;或因外傷，血瘀氣滯，積瘀成疽，聚毒而為病[3]。最初記載于《諸病源候論》：“附骨癰……與熱氣相搏，伏結(jié)近骨成疽……謂之附骨癰也?！?/p>

透膿散，始出《外科正宗》，記載可治癰瘡諸毒，內(nèi)膿不透之病。方由當(dāng)歸、穿山甲、皂角刺、黃芪、川芎等五味藥組成。生黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)、托毒排膿，為瘡家之圣藥;當(dāng)歸補(bǔ)血和血，祛體內(nèi)之積血;川芎補(bǔ)血活血，養(yǎng)新血破積血，行血中之氣，二者常合用來(lái)養(yǎng)血合營(yíng)。皂角刺可托毒排膿、引藥上行，助黃芪透散之力，直達(dá)病所，消脈絡(luò)之積，祛陳腐之氣。全方合用共奏補(bǔ)虛脫毒、潰瘡?fù)改撝?。目前臨床上常用透膿散治療慢性骨髓炎，在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中效果顯著[4-5]。本研究運(yùn)用中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選透膿散中部分藥物的活性化合物及其作用靶點(diǎn)，形成“藥物-化合物-靶點(diǎn)”，并預(yù)測(cè)信號(hào)通路，分析透膿散治療慢性骨髓炎的相關(guān)分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分篩選 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），分別以“黃芪”“當(dāng)歸”“皂角刺”“川芎”檢索透膿散中部分中藥活性化合物成分，其中因穿山甲為國(guó)家保護(hù)動(dòng)物，且2020年《中華人民共和國(guó)藥典》也將穿山甲移除，為遵守國(guó)家相關(guān)動(dòng)物保護(hù)條例，防止出現(xiàn)因藥物特殊療效引起的穿山甲捕殺情況，未對(duì)其進(jìn)行檢索分析。根據(jù)藥物的吸收、分布、代謝和排泄原則，口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）越高，類(lèi)藥性（Drug Likeness，DL）越高。結(jié)合以往文獻(xiàn)選取OB≥30%、DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)[6]，篩選出黃芪、當(dāng)歸、皂角刺、川芎的活性化合物中符合標(biāo)準(zhǔn)的成分進(jìn)行分析。

1.2 藥物作用疾病靶點(diǎn)篩選 通過(guò)TCMSP檢索篩選得到的活性化合物成分，查找靶點(diǎn)蛋白，運(yùn)用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)所有靶點(diǎn)蛋白所對(duì)應(yīng)的genename，并合并重復(fù)值，刪除無(wú)對(duì)應(yīng)genename的靶點(diǎn)蛋白。運(yùn)用Cytoscape 3.7.2分析并構(gòu)建“藥物-化合物-靶點(diǎn)”。

1.3 靶點(diǎn)間相互作用分析 在疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索“Chronic osteomyelitis”相關(guān)疾病基因[7]。將之前得到的藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，所得的交集部分作為透膿散治療慢性骨髓炎的潛在治療靶點(diǎn)。將上述得到的潛在靶點(diǎn)從STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[8]以“Homo Sapiens”為界定進(jìn)行分析，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）關(guān)系，并應(yīng)用Cytoscape分析得到核心作用靶點(diǎn)。

1.4 作用機(jī)制圖繪制及預(yù)測(cè) 分析篩選出來(lái)的潛在作用靶點(diǎn)基因、信號(hào)通路，應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，以P<0.05，物種“Homo Sapiens”，進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號(hào)通路分析[9]。GO富集分析選用Biological process、Molecular function、Cellular components按照其靶點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行排序，選取富集的前20條，并繪制氣泡圖，通過(guò)Omicshare云平臺(tái)繪制KEGG通路富集。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分 根據(jù)OB≥30%、DL≥0.1得到透膿散中化合物共431個(gè)，包括異黃酮、福莫寧等。表1為透膿散部分活性化合物。

2.2 藥物作用靶點(diǎn) 運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建圖1的透膿散中“藥物-活性化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

2.3 透膿散治療慢性骨髓炎的潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到438個(gè)慢性骨髓炎的潛在靶點(diǎn)。制作交叉驗(yàn)證靶標(biāo)韋恩圖，共得到46個(gè)交集靶點(diǎn)，將這46個(gè)靶點(diǎn)視為“透膿散”治療慢性骨髓炎的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

2.4 靶PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將透膿散治療慢性骨髓炎的46個(gè)交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析，利用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行靶PPI網(wǎng)絡(luò)分析，靶點(diǎn)Degree值越大，形狀越大，顏色越深，平均節(jié)點(diǎn)度值為26.09，其中度值大于24的靶蛋白有32個(gè)，表明這幾個(gè)靶點(diǎn)在韋恩網(wǎng)絡(luò)中起了關(guān)鍵作用，可以作為透膿散治療慢性骨髓炎的重要預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。見(jiàn)圖3。篩選出網(wǎng)絡(luò)中排名前10的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖4，詳細(xì)信息見(jiàn)表3。

2.5 GO功能富集分析及KEGG信號(hào)通路富集分析 將46個(gè)潛在靶點(diǎn)提交DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中，按照P<0.05進(jìn)行篩選，選取富集基因前20進(jìn)行分析，其中涉及368個(gè)生物過(guò)程（Biological Process，BP）（圖5）、43種分子功能（Molecular Function，MF）（圖6）和22類(lèi)細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）（圖7）。主要涉及細(xì)胞增殖、免疫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、毒性反應(yīng)、蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性、相同的蛋白結(jié)合、蛋白均二聚活性、蛋白異二聚體活性、細(xì)胞外空間、細(xì)胞質(zhì)、膠質(zhì)溶膠、細(xì)胞外泌體、線(xiàn)粒體基因等。

將46個(gè)潛在靶點(diǎn)提交DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中，按照P<0.05篩選，進(jìn)行KEGG通路富集分析，涉及88條信號(hào)通路，主要涉及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）、破骨細(xì)胞分化、瘧疾、甲型流感、核因子κB信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。繪制排名前20的氣泡圖。見(jiàn)圖8。根據(jù)蛋白質(zhì)與信號(hào)通路之間的關(guān)系，選取關(guān)鍵靶點(diǎn)，借助Cytoscape 3.7.2軟件，繪制“靶點(diǎn)-通路”圖。見(jiàn)圖9。綠色菱形為通路，紅色圓形為靶點(diǎn)。

3 討論

慢性骨髓炎是骨科臨床上并不少見(jiàn)的慢性骨感染性疾病，無(wú)明顯年齡發(fā)病特點(diǎn)，任何行骨折手術(shù)治療的患者都有可能發(fā)生，多為急性骨髓炎的延續(xù)，易復(fù)發(fā)。其治療失敗可能導(dǎo)致骨折內(nèi)固定失敗、死骨和竇道形成、長(zhǎng)期排膿、甚至惡變等嚴(yán)重后果，影響

患者的身體健康、生命質(zhì)量，對(duì)患者造成巨大的精神負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[10]。目前常用的治療方式多為高級(jí)抗生素配合下的手術(shù)治療[11-14]，但手術(shù)的缺點(diǎn)是次數(shù)多、創(chuàng)傷大、患者的心理壓力較大，并且一般會(huì)出現(xiàn)抗生素的不良反應(yīng)。有臨床治療經(jīng)驗(yàn)及臨床觀察表明，透膿散可以有效消除局部病灶癥狀，改善身體整體狀況，加速愈合，并有效預(yù)防復(fù)發(fā)[4-5，15]。

本研究結(jié)果表明，透膿散中包含431個(gè)化合物，40個(gè)活性成分，227個(gè)作用靶點(diǎn)，透膿散治療慢性骨髓炎的潛在作用靶點(diǎn)195個(gè)，篩選得到46個(gè)關(guān)鍵化合物，根據(jù)中心度值及等級(jí)值，從高到低依次是槲皮素、山柰酚、谷甾醇、豆甾醇、fisetin，其中槲皮素的度值最高為285。槲皮素可以抗炎癥反應(yīng)、抗病毒、抗腫瘤、降低血糖及免疫調(diào)節(jié)等作用[16]。Britti等[17]發(fā)現(xiàn)槲皮素聯(lián)合棕櫚酰乙醇酰胺可以大大改善大鼠關(guān)節(jié)炎模型的活動(dòng)度、疼痛指數(shù)、組織學(xué)評(píng)分，還可通過(guò)降低TNF-α、IL-1β、IL-6等的表達(dá)發(fā)揮治療關(guān)節(jié)炎的作用。李陽(yáng)等[18]發(fā)現(xiàn)，槲皮素對(duì)肝臟氧化損傷有保護(hù)作用。山柰酚具有抗癌細(xì)胞、治療糖尿病、保護(hù)損傷細(xì)胞等功能，并且可以調(diào)節(jié)Ca代謝，促進(jìn)膠原產(chǎn)生，減少骨小梁丟失間接治療骨質(zhì)疏松，因此山柰酚對(duì)于慢性骨髓炎造成的骨丟失可能會(huì)有一定的幫助作用[19-20]。谷甾醇、豆甾醇是常見(jiàn)植物甾醇，具有抵抗炎癥、參與免疫調(diào)節(jié)。Chen等[21]在大鼠OA模型中發(fā)現(xiàn)豆甾醇能夠降低軟骨降解，并顯著抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMP）的表達(dá)，可能被認(rèn)為是一種治療關(guān)節(jié)炎的可行藥物;并且豆甾醇還具有抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛以及治療糖尿病的作用[22]。fisetin可以影響細(xì)胞內(nèi)血紅素加氧酶（Heme Oxygenase，HO）-1的表達(dá)，清除細(xì)胞內(nèi)活性氧，通過(guò)減少氧化損傷，從而對(duì)于細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用，對(duì)于慢性病有一定的預(yù)防作用[23]。

透膿散在治療慢性骨髓炎的PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果分析中，其中46個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白中IL-6、AKT1、VEGFA、MMP9、TP53等靶點(diǎn)是透膿散治療慢性骨髓炎的主要作用靶點(diǎn)。IL6是主要的炎癥介質(zhì)，也是骨性關(guān)節(jié)炎等發(fā)病的重要介質(zhì)，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[24]。蛋白激酶（AKT1）同樣也是參與炎癥反應(yīng)的物質(zhì)之一，有研究表明，上調(diào)OA模型大鼠的微小RNA-543，可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，拮抗IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷，下調(diào)鼠雙微體（Mouse Double Minute4，MDM4）表達(dá)、上調(diào)AKT1、Bcl-2等的表達(dá)，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，并且AKT1對(duì)于對(duì)抗軟骨細(xì)胞的損傷也有一定的作用[25-26]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）具有抗成骨細(xì)胞凋亡，維系成骨細(xì)胞的成活促進(jìn)局部成骨的作用[27]。另外，VEGF的表達(dá)還與滑膜炎癥、軟骨變性及軟骨細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)[28]。MMP是具有降解幾乎所有細(xì)胞外基質(zhì)功能的酶，存在于正常人體內(nèi)，參與傷口愈合、軟骨基質(zhì)降解、骨吸收過(guò)程，該物質(zhì)的減少也可以減少炎癥介質(zhì)的釋放，調(diào)整異常的基質(zhì)降解和血管形成等，從而起到炎癥緩解、減少軟骨和骨質(zhì)破壞[29]。腫瘤蛋白P53則參與癌癥細(xì)胞凋亡，參與抑癌細(xì)胞的侵襲遷移及細(xì)胞凋亡過(guò)程[30]。

GO富集分析主要涉及細(xì)胞增殖、免疫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等。KEGG主要涉及類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、瘧疾、甲型流感、破骨細(xì)胞分化、核因子κB信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路。而進(jìn)一步分析可以看出，核因子κB信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路均涉及到類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、破骨細(xì)胞分化，二者通過(guò)相互作用，抑制炎癥介質(zhì)的釋放和成骨細(xì)胞的分化[31-32]，并且TNF信號(hào)通路還可以介導(dǎo)炎癥介質(zhì)TNF-α，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。核因子κB通過(guò)對(duì)多種基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，影響機(jī)體免疫反應(yīng)，從而在機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。由此分析可以得出，核因子κB信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路可以通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)釋放以及免疫調(diào)節(jié)作用達(dá)到炎癥緩解的作用，增加機(jī)體免疫力等，以達(dá)到緩解或治療慢性骨髓炎的效果。

綜上所述，通過(guò)分析預(yù)測(cè)，該中藥復(fù)方可能通過(guò)細(xì)胞增殖、凋亡、免疫炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮治療作用，通過(guò)該分析，可以將透膿散作為治療慢性骨髓炎的一種長(zhǎng)期服用藥物，大大降低了長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素對(duì)于機(jī)體的不良影響。但是本研究有一定局限性，對(duì)于中藥的反應(yīng)因人而異、要嚴(yán)格辨證論治，另外因數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)不全或者篩選原因以及某些珍貴稀有藥物的原因，造成了某些中藥未進(jìn)行檢索等。因此詳細(xì)的治療機(jī)制和臨床療效仍需要臨床去驗(yàn)證。

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（2020-07-28收稿 本文編輯：張雄杰）

基金項(xiàng)目：山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2019-0144）

作者簡(jiǎn)介：郭光鑫（1995.08—），男，碩士研究生在讀，研究方向：中醫(yī)骨傷科學(xué)，E-mail：962246009@qq.com

通信作者：管東輝（1974.07—），男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)骨傷科學(xué)，E-mail：guanyisheng0720@163.com