苗 宇，張浩陽(yáng)，張麗佳，劉美君，王 爽

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 新疆 烏魯木齊 830052）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是我國(guó)北方主要栽培牧草，在新疆廣泛種植，是豆科牧草中耐鹽性較好的牧草[1]，具有抗逆性強(qiáng)、耐鹽、耐旱、耐風(fēng)沙、抗病蟲(chóng)害、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，是牛、羊等草食性牲畜的重要飼料。但新疆土壤鹽漬化嚴(yán)重[2]，嚴(yán)重影響了苜蓿的生長(zhǎng)，因此研究苜蓿的抗鹽機(jī)理對(duì)苜?？果}品種的選育以及苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要意義。

根系是植物接觸土壤、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分的主要器官，根系對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)是植物抗鹽生理的重要研究?jī)?nèi)容。目前，關(guān)于鹽脅迫對(duì)苜蓿根系傷害的研究主要集中在氧化傷害、滲透調(diào)節(jié)及細(xì)胞膜的完整性3個(gè)方面。如周萬(wàn)海等[3]在研究鹽脅迫對(duì)苜蓿根系生長(zhǎng)和氧化損傷中發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫使根系游離脯氨酸、 丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量顯著上升(P＜ 0.05)，破壞了根系細(xì)胞膜的完整性。張永志等[4]研究也表明紫花苜?！熊僖惶?hào)’隨著NaCl濃度的增加脯氨酸、MDA含量隨之增加。Torabi和Halim[5]研究發(fā)現(xiàn)20個(gè)生態(tài)型苜蓿苗期根系脯氨酸均在鹽脅迫下誘導(dǎo)了脯氨酸的積累，使苜蓿根系進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)。除了對(duì)氧化傷害和根系滲透調(diào)節(jié)等影響外，研究表明鹽脅迫會(huì)抑制植物根系吸收其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，造成植物營(yíng)養(yǎng)虧缺[6]，最終導(dǎo)致植株死亡。

植物幼苗階段與萌發(fā)階段最大的區(qū)別就是形成了葉片，具有積累有機(jī)物的能力，光合機(jī)構(gòu)活性的高低以及葉片滲透調(diào)節(jié)能力[7]的大小可以作為評(píng)價(jià)植物葉片的耐鹽性指標(biāo)。王保平等[8]研究發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl濃度的升高，紫花苜蓿葉片脯氨酸含量增加，且堿性脅迫使苜蓿葉片積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。Wang和Han[9]研究結(jié)果表明，鹽脅迫下兩個(gè)紫花苜蓿品種的MDA含量會(huì)增加，但‘中苜一號(hào)’MDA含量較少?？芙瓭萚10]和Li[11]研究均表明NaCl脅迫降低了葉片PSⅡ反應(yīng)中心活性、葉綠素含量和葉片的光合速率。綜上，鹽脅迫會(huì)使苜蓿根系、葉片造成氧化傷害破壞其膜結(jié)構(gòu)完整，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增加[12]、降低葉片光系統(tǒng)(PSⅡ)反應(yīng)中心活性，限制苜蓿幼苗的生長(zhǎng)、發(fā)育。

自2000年以來(lái)，新疆苜蓿種植面積不斷擴(kuò)大，但受到多種非生物因素的影響土壤鹽漬化就是其中之一[13]。而新疆各類(lèi)鹽漬土總面積達(dá)1.62 × 106hm2[14]，且鹽漬化土壤富含多種類(lèi)型鹽離子，嚴(yán)重影響苜蓿的生長(zhǎng)，制約苜蓿產(chǎn)業(yè)在新疆的發(fā)展。國(guó)內(nèi)外有關(guān)鹽脅迫對(duì)苜蓿生長(zhǎng)影響的研究主要集中在單鹽脅迫對(duì)植物的影響，但不同種類(lèi)鹽脅迫下苜蓿生長(zhǎng)是否有差異，以及混鹽情況下不同鹽分對(duì)苜蓿生長(zhǎng)是否有協(xié)同或拮抗作用尚未可知。因此，本研究從單鹽、混鹽角度，研究了單獨(dú)NaCl和KCl處理以及混鹽相互作用對(duì)紫花苜蓿幼苗階段根系和葉片光合活性的影響，以期為苜蓿耐鹽品種的培育以及鹽堿地苜蓿的種植推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為‘新牧4號(hào)’紫花苜蓿，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1脅迫濃度

選用長(zhǎng)勢(shì)一致的紫花苜蓿幼苗，設(shè)置4組處理。第1組：NaCl溶液濃度處理分別設(shè)為0、50、100和200 mmol·L-1；第2組：KCl溶液濃度分別設(shè)置為0、50、100和200 mmol·L-1；第3組：200 mmol·L-1NaCl + 20 mmol·L-1KCl混合；第4組：20 mmol·L-1NaCl + 200 mmol·L-1KCl混合。

1.2.2試驗(yàn)測(cè)定

選用直徑為20 cm的花盆，并用殺菌消毒后的蛭石在25 ℃下光照培養(yǎng)箱中培育，紫花苜蓿長(zhǎng)出兩片子葉后按照上述鹽溶液的濃度脅迫處理，脅迫處理7 d后進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定，根系與葉片每份樣品取0.2 g，測(cè)定能反映NaCl和KCl脅迫的影響指標(biāo)有根系的膜透性(相對(duì)電導(dǎo)率)、根系氧化脅迫(MDA含量)、根系滲透調(diào)節(jié)作用(脯氨酸含量)以及反映根系酶活性的根系活力，葉片的葉綠素含量和脯氨酸含量。

將處理后的幼苗分別放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行光照處理，分別在0 和4 h后測(cè)定葉片的最大光化學(xué)效率(maximum photochemical efficiency，F(xiàn)v/Fm)[15]。

1.2.3指標(biāo)測(cè)定方法

相對(duì)電導(dǎo)率：是反映植物細(xì)胞膜透性的生理指標(biāo)，值越大說(shuō)明細(xì)胞在脅迫的環(huán)境下受到的傷害越大，采用浸泡法測(cè)定[16]。

MDA含量：是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一，MDA的產(chǎn)生能加劇膜的損傷，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[17]。

脯氨酸含量：是植物蛋白質(zhì)的組分之一，植物在逆境條件下，會(huì)使脯氨酸大量累積，作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)提高植物的抗逆性。采用酸性茚三酮比色法測(cè)定脯氨酸含量[18]。

根系活力：采用TTC法測(cè)定根系活力[19]。

葉綠素含量：采用無(wú)水乙醇浸提法測(cè)定[20]。

Fv/Fm：采用FluorPen FP 110手持式葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)同濃度下不同鹽處理用t檢驗(yàn)分析，不同濃度鹽處理、同一鹽處理后不同時(shí)間光照間進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較；采用Excel 2019制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脅迫對(duì)幼苗根系的影響

2.1.1不同脅迫對(duì)幼苗根系細(xì)胞膜完整度的影響

在50、100、200 mmol·L-1KCl處理下紫花苜蓿根系相對(duì)電導(dǎo)率顯著大于NaCl處理(P＜ 0.05) (圖1A)。在200 mmol·L-1NaCl加入20 mmol·L-1的KCl相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于200 mmol·L NaCl (P＜ 0.05)，提升了9.46%。而在200 mmol·L-1KCl下加入20 mmol·L-1NaCl相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于200 mmol·L-1KCl (P＜0.05)，降低了5.80%。后者相對(duì)電導(dǎo)率降低，對(duì)紫花苜蓿的細(xì)胞膜的傷害程度減小(圖1B)。相對(duì)電導(dǎo)率的變化也顯示，兩組混鹽相比較，200 mmol·L-1KCl + 20 mmol·L-1NaCl顯著升高(P＜ 0.05)，變化為正值。這說(shuō)明少量Na+能緩解紫花苜蓿幼苗在KCl脅迫下根系細(xì)胞膜的完整度。

圖1 不同鹽脅迫后紫花苜蓿根系電導(dǎo)率Figure 1 Electrical conductivity of alfalfa root system after different salt stress treatments

2.1.2不同脅迫下幼苗根系細(xì)胞的氧化傷害

NaCl和KCl在CK、50 mmol·L-1時(shí)，根系MDA的含量無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)，此后隨鹽濃度升高，MDA含量升高，且相同濃度下KCl處理顯著大于NaCl (P＜ 0.05) (圖2A)。當(dāng)在200 mmol·L-1KCl中加入20 mmol·L-1的NaCl顯著降低了MDA含量(P＜ 0.05)，但在200 mmol·L-1NaCl中加入20 mmol·L-1的KCl增加了MDA的含量(圖2B)，這說(shuō)明少量NaCl緩解了KCl脅迫對(duì)苜蓿根系造成的氧化傷害，從而降低了根系細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度。

圖2 不同鹽脅迫后紫花苜蓿根系丙二醛含量Figure 2 Malondialdehyde content of alfalfa roots after different salt stress treatments

2.1.3不同脅迫下幼苗根系細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)作用

隨著鹽濃度的增加，根系脯氨酸含量逐漸上升，說(shuō)明鹽脅迫導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的離子失調(diào)，細(xì)胞產(chǎn)生了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸。除了CK外，在相同鹽濃度下比較，KCl脅迫脯氨酸含量顯著大于NaCl脅迫(P＜ 0.05)，這也就說(shuō)明KCl導(dǎo)致的離子失衡更嚴(yán)重(圖3A)。在200 mmol·L-1NaCl加 入20 mmol·L-1的KCl相比于單鹽NaCl脯氨酸含量沒(méi)有顯著上升(P＞ 0.05)，但當(dāng)在200 mmol·L-1KCl中加入20 mmol·L-1的NaCl使脯氨酸含量相比與單鹽KCl顯著升高(P＜ 0.05) (圖3B)。這表明混鹽使根系細(xì)胞的離子失調(diào)程度更大，并且少量的Na+可以促進(jìn)在大量KCl脅迫下的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的生成，以更好地抵抗離子失調(diào)。

圖3 不同鹽脅迫后紫花苜蓿根系脯氨酸含量Figure 3 Proline content of alfalfa root system after different salt stress treatments

2.1.4不同脅迫對(duì)幼苗根系活力的影響

根系活力隨鹽濃度的上升而下降(圖4A)，即根細(xì)胞的酶活性隨鹽濃度升高而下降，使得細(xì)胞內(nèi)氫的含量上升，對(duì)細(xì)胞而言又是一種傷害。高濃度KCl下根系活力低于NaCl脅迫，但不顯著(P＞ 0.05)。混鹽均可使根系活力上升，且混鹽均顯著高于相對(duì)應(yīng)的單鹽(P＜ 0.05) (圖4B)。通過(guò)對(duì)比兩種不同的混鹽根系活力發(fā)現(xiàn)，在200 mmol·L-1的KCl加入20 mmol·L-1NaCl根系活力顯著(P＜ 0.05)高于200 mmol·L-1NaCl處 理 中 加 入20 mmol·L-1KCl，200 mmol·L-1KCl + 20 mmol·L-1NaCl和200 mmol·L-1NaCl + 20 mmol·L-1KCl與單鹽KCl和單鹽NaCl處理相比，分別上升了46.05%、23.57%。說(shuō)明在大量的KCl中加入少量NaCl對(duì)根系活力的影響更大，其根系活力明顯增加、細(xì)胞內(nèi)的酶活性顯著提高(P＜ 0.05)。

圖4 不同鹽脅迫后紫花苜蓿根系活力Figure 4 Root vigor of alfalfa after different salt stress treatments

2.2 不同鹽脅迫對(duì)幼苗葉片色素的影響

紫花苜蓿葉綠素含量、葉綠素a、葉綠素b均隨著鹽濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。葉綠素總含量在NaCl脅迫下50 mmol·L-1的鹽濃度時(shí)達(dá)到最大值，這可能是低濃度的鹽促進(jìn)了葉綠素的形成(圖5A)。對(duì)比KCl和NaCl脅迫，發(fā)現(xiàn)葉綠素a在濃度梯度下均無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)，葉綠素與葉綠素b含量在50 和200 mmol·L-1的兩鹽處理下有顯著差異(P＜ 0.05)，KCl紫花苜蓿葉綠素的含量明顯下降，且小于NaCl脅迫。

圖5 不同脅迫后紫花苜蓿各葉綠素含量的變化Figure 5 Changes in the chlorophyll content of alfalfa after different treatments

在200 mmol·L-1的KCl和NaCl中分別加入20 mmol·L-1的NaCl和KCl可發(fā)現(xiàn)其葉綠素含量均有所升高(圖6)，但在200 mmol·L-1的KCl中加入20 mmol·L-1NaCl其葉綠素總含量顯著高于200 mmol·L-1的KCl (P＜ 0.05)，其變化也最大，也就說(shuō)明緩解效果更好。

圖6 混鹽脅迫后紫花苜蓿葉綠素含量的變化Figure 6 Changes in the chlorophyll content of alfalfa after mixed salt stress

KCl脅迫與NaCl脅迫葉片類(lèi)胡蘿卜素含量在50 mmol·L-1時(shí)有顯著差異(P＜ 0.05) (圖7A)，但其他濃度差異不顯著(P＞ 0.05)。兩組混鹽處理均增加了類(lèi)胡蘿卜素含量，且加入少量NaCl處理的增加顯著大于單鹽KCl，提升了16.06% (P＜ 0.05)。(圖7B)。這 說(shuō) 明200 mmol·L-1KCl + 20 mmol·L-1NaCl處理組使胡蘿卜素淬滅過(guò)剩光能的功能得到了提升。

圖7 不同鹽脅迫后紫花苜蓿類(lèi)胡蘿卜素含量的變化Figure 7 Carotenoid content of alfalfa after differentsalt stress treatments

2.3 不同鹽脅迫對(duì)幼苗葉片最大光化學(xué)效率的影響

與黑暗條件相比，光照4 h使得最大光化學(xué)效率顯著下降(P＜ 0.05)，說(shuō)明葉片在強(qiáng)光下產(chǎn)生了光抑制。當(dāng)在高濃度KCl和NaCl中分別加入20 mmol·L-1NaCl和20 mmol·L-1KCl時(shí)，F(xiàn)v/Fm無(wú)顯著變化(圖8)。4 h的強(qiáng)光處理下在200 mmol·L-1KCl+20 mmol·L-1NaCl和200 mmol·L-1NaCl+20 mmol·L-1KCl與單鹽KCl和單鹽NaCl相比，F(xiàn)v/Fm分別提升了0.54%和降低了6.70%。故少量NaCl更能夠緩解苜蓿在高濃度KCl脅迫后強(qiáng)光照射產(chǎn)生的PSⅡ的光抑制。

圖8 不同鹽脅迫后紫花苜蓿Fv/Fm的變化Figure 8 Changes in Fv/Fm of alfalfa after different salt stress treatments

2.4 不同鹽脅迫對(duì)幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

葉片脯氨酸含量在鹽濃度100 和200 mmol·L-1下有顯著差異(P＜ 0.05)，即KCl處理使葉片產(chǎn)生更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(圖9A)。加入少量的NaCl和KCl都會(huì)使200 mmol·L-1的KCl和NaCl的葉片脯氨酸含量下降，但在200 mmol·L-1的NaCl中加入少量的KCl的下降量并不顯著(P＞ 0.05)，下降了8.30%。而200 mmol·L-1KCl中加入少量的NaCl相比與單鹽KCl顯著下降了9.04% (P＜ 0.05) (圖9B)。即少量的NaCl更能減輕葉片高KCl的滲透脅迫。

圖9 不同鹽脅迫后紫花苜蓿葉片脯氨酸含量Figure 9 Proline content of alfalfa leaves after different salt stress treatments

3 討論

植物根系是最早感知外界鹽濃度的器官，是吸收水分和礦質(zhì)離子的最主要的部位。鹽脅迫通過(guò)抑制植物的根長(zhǎng)、根系活力等影響植物的生長(zhǎng)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿根系活力隨著鹽濃度的上升根系活力隨之下降并且K+的傷害程度大于Na+，其原因可能是植物中K+比Na+利用程度大[22]。這一結(jié)果在其他植物上也得到驗(yàn)證[23-24]。在對(duì)甜菜(Beta vulgaris)的研究上認(rèn)為，植物利用K+的程度大于Na+且KCl對(duì)甜菜生長(zhǎng)及根系的傷害更大[25]。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的增加和脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，秋茄(Kandelia obovata)根中MDA含量等隨著鹽濃度的增加呈上升趨勢(shì)。當(dāng)植物處于鹽脅迫下根系細(xì)胞吸收大量鹽離子導(dǎo)致細(xì)胞中大量積累鹽離子打破原有的Na+/K+平衡，破壞植物維持細(xì)胞內(nèi)外的離子平衡，最終影響植物的整個(gè)代謝[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，少量的Na+減輕了大量K+的傷害，保持了膜的完整性，維持了根系細(xì)胞內(nèi)的滲透平衡及根系的正常生長(zhǎng)。這可能是植物細(xì)胞內(nèi)的鈉鉀泵在離子平衡中起重要作用，消耗腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)分子，維持細(xì)胞的靜息電位。

與根系相比，KCl脅迫同樣比NaCl對(duì)葉片的傷害大[28-29]，房朋等[30]研究指出，Na+的虧缺和高濃度K+的積聚可能是導(dǎo)致高濃度KCl對(duì)雜交酸模光合活性的傷害比NaCl更嚴(yán)重的主要原因。而王寶山等[31]認(rèn)為，葉片中KCl造成的傷害大于NaCl的原因是KCl破壞了Ca+的吸收。與根系不同的是不同配比的混鹽對(duì)鹽脅迫對(duì)葉片的傷害均有緩解作用，且少量的NaCl對(duì)過(guò)量KCl的緩解作用更大。這與熊雪等[32]的試驗(yàn)結(jié)論相似。當(dāng)苜蓿受到鹽脅迫時(shí)，葉片受到氧化傷害、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)上升、葉片的葉綠素被降解[33-34]。本研究結(jié)果表明，單鹽處理時(shí)MDA、脯氨酸、葉綠素隨著鹽濃度升高而升高，K+和Na+混合脅迫下，植物對(duì)Na+的吸收，抑制了K+的積累，緩解了葉片受到的傷害。值得注意的是，目前鹽脅迫對(duì)葉綠素含量的影響并不統(tǒng)一，但就本研究來(lái)說(shuō)，低濃度單鹽脅迫時(shí)，葉綠素含量升高其原因可能是由于低鹽促使細(xì)胞積累脯氨酸而脯氨酸的積累有利于葉綠素的合成[35](圖5)。此外，當(dāng)植物受到鹽脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生保護(hù)酶和非酶促的防御系統(tǒng)[36]，類(lèi)胡蘿卜素就是其中的還原性物質(zhì)，而本研究單鹽處理時(shí)類(lèi)胡蘿卜素含量先下降后升高、混鹽處理下少量NaCl緩解KCl脅迫可能也與它的保護(hù)性有關(guān)。Fv/Fm反映了葉片PSⅡ的最大光化學(xué)效率[37]，在鹽脅迫下PSⅡ的變化能反映出鹽脅迫對(duì)光合作用的影響。少量NaCl能夠緩解在植物受到高濃度KCl脅迫后強(qiáng)光照射產(chǎn)生的光抑制，使得Fv/Fm升高，這可能是由于少量的NaCl維持了離子平衡，使得KCl脅迫對(duì)紫花苜蓿光合作用影響降低。

本研究表明，高濃度的K+使得苜蓿細(xì)胞內(nèi)離子平衡失衡而加入少量Na+能維持離子平衡，使得大量的K+離開(kāi)細(xì)胞，進(jìn)而使得脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量降低，減少KCl脅迫對(duì)紫花苜蓿的傷害。但也有研究指出K+的施用也能減輕Na+的脅迫，如Mehreen[38]研究表明適度提高小麥(Triticum aestivum)幼苗的K+施用量可以降低組織和細(xì)胞內(nèi)Na+濃度，并通過(guò)減輕Na+毒害的有害影響提高小麥生長(zhǎng)和產(chǎn)量。本研究強(qiáng)調(diào)了在相同濃度NaCl和KCl水平下，Na+及K+配施對(duì)苜蓿幼苗葉片和根系的影響，為苜蓿在鹽漬化土地上的種植提供理論指導(dǎo)。

4 結(jié)論

綜上所述，鹽脅迫破壞了幼苗根系膜的完整性、限制了葉片的光合效率，最終影響紫花苜蓿的生長(zhǎng)發(fā)育且KCl傷害大于NaCl。補(bǔ)加低濃度的NaCl減輕了高濃度的KCl對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的滲透脅迫，減緩了細(xì)胞的氧化傷害，從而減輕了對(duì)膜完整性以及光合機(jī)構(gòu)的傷害，緩解了KCl對(duì)紫花苜蓿的生長(zhǎng)發(fā)育的影響。