李 晶，李 娜，丁 品，付麟雲(yún)，王 濤，杜文靜，張建軍，武建榮，劉錦霞

（1. 甘肅省科學(xué)院生物研究所, 甘肅 蘭州 730000；2. 甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院, 甘肅 蘭州 730000）

黃帚橐吾(Ligularia virgaurea)、箭葉橐吾(L.sagitta)和藏橐吾(L. rumicifolia)同屬于菊科橐吾屬(Ligularia)植物，主要分布于青藏高原東北部、云南西北部、甘肅、青海、四川等高海拔地區(qū)的草地、濕地、沼澤、草甸及灌叢中，是甘肅省甘南地區(qū)草地中的優(yōu)勢(shì)毒雜草，現(xiàn)已成為甘南草地退化的標(biāo)志之一[1]。目前，對(duì)于草原毒雜草的綜合治理成為當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境保護(hù)、草地修復(fù)的重中之重。有研究表明化學(xué)除草劑可清除黃帚橐吾等毒雜草，但同時(shí)會(huì)威脅其他牧草的安全，在植物生長(zhǎng)、生物多樣性等方面對(duì)牧草造成藥害[2]，且化學(xué)藥劑的大量施用，會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥成份殘留、累積[3]，對(duì)牧場(chǎng)動(dòng)、植物和整個(gè)草地生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生潛在威脅。

近年來(lái)，開(kāi)發(fā)黃帚橐吾等草原毒雜草綜合利用價(jià)值的研究越來(lái)越多[1,4-9]，這不僅為生物農(nóng)藥研發(fā)拓展了新的資源，也從“變害為利”的角度為草原毒雜草的治理提供了新思路。隨著人民生活水平的提高，減少使用化學(xué)農(nóng)藥的需求日益顯現(xiàn)，而植物源農(nóng)藥“取之于自然，用之于自然”。植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生參與自身防御的次生代謝產(chǎn)物，利用這些產(chǎn)物不利于有害生物的特性可開(kāi)發(fā)成為植物源農(nóng)藥[10]，因其具有天然、有效、安全、環(huán)保無(wú)污染等特性，成為替代化學(xué)農(nóng)藥，實(shí)現(xiàn)綠色可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)的有效手段之一。已有研究表明：紫莖澤蘭(Ageratina adenophora)精油中所含的單萜烯粒和含氧單萜類(lèi)化合物, 對(duì)玉米象(Sitophilus zeamais)、米象(Sitophilus oryzae)、蠶豆象(Bruchus rufimanus)、綠豆象(Callosobruchuschinensis) 4種倉(cāng)庫(kù)害蟲(chóng)具有很強(qiáng)的熏殺活性[4]；瑞香狼毒(Stellera chamaejasme)根乙醇提取物對(duì)云紋粉蝶(Appias indra)幼蟲(chóng)、榆白長(zhǎng)翅卷蛾(Acleris ulmicola)幼蟲(chóng)有較強(qiáng)的觸殺活性[5]；白喉烏頭(Aconitum leucostomum)總生物堿提取物能抑制植物病原菌菌絲的生長(zhǎng)，且能觸殺棉蚜(Aphis gossypii)[6]。黃帚橐吾莖葉甲醇提取物對(duì)菜粉蝶(Pieris rapae)幼蟲(chóng)有較強(qiáng)的拒食和觸殺作用[7]，對(duì)水稻紋枯病菌和玉米大斑病菌也有較強(qiáng)的抑制作用[8]。黃帚橐吾乙醇提取物對(duì)保護(hù)地辣椒(Capsicum annuum) 4種常見(jiàn)的真菌性病原菌及其所致病害有較好的抑菌及防治效果，防效可達(dá)75%以上[9]；對(duì)棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)有很強(qiáng)的農(nóng)藥生物活性，主要表現(xiàn)為對(duì)受試害蟲(chóng)較強(qiáng)的胃毒和拒食作用[1]。根據(jù)連續(xù)幾年的實(shí)地調(diào)查，箭葉橐吾和藏橐吾的數(shù)量在草場(chǎng)毒雜草中所占的比例均逐年增多，但對(duì)于這兩種植物的農(nóng)藥活性研究還未見(jiàn)報(bào)道。

玉米(Zea mays)是甘肅省主要種植的農(nóng)作物之一，而玉米粘蟲(chóng)(Mythimna separata)是危害玉米產(chǎn)量的主要害蟲(chóng)，能造成受侵害玉米地大面積減產(chǎn)甚至絕收[11]。同時(shí)，甘肅省也是高原夏菜的主產(chǎn)區(qū)，尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)寄主范圍十分廣泛，不僅是辣椒枯萎病的病原菌[12]，還可引起茄科、豆科和十字花科等100多種植物相應(yīng)病害的發(fā)生[13]，造成較大經(jīng)濟(jì)損失。針對(duì)上述情況，本研究將以上兩種病蟲(chóng)害作為受試體，以黃帚橐吾、箭葉橐吾和藏橐吾3種甘南草場(chǎng)中常見(jiàn)的毒雜草為研究對(duì)象，測(cè)定和對(duì)比其提取物對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)和尖孢鐮刀菌的農(nóng)藥生物活性，為植物源生物農(nóng)藥的研發(fā)開(kāi)拓資源、奠定基礎(chǔ)，也為草原有害毒雜草的綜合治理提供新的途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

提取物制備及藥液配制：7月 - 8月收集黃帚橐吾、箭葉橐吾和藏橐吾地上部分植株，陰干、粉碎機(jī)粉碎。采用冷浸法進(jìn)行提?。簩⒅仓旮刹牧吓c90%乙醇按照體積比1 : 10混勻浸泡，每12 h翻攪混勻一次，浸泡72 h后，將浸出液用16層紗布濾出。如此反復(fù)3次。浸出液經(jīng)兩層中速濾紙抽濾后減壓蒸餾，條件為30～35 ℃、0.075～0.080 MPa，得到褐色或褐綠色有特異氣味的浸膏。配制試驗(yàn)用藥時(shí)，將吐溫-80作為助溶劑，與浸膏按照0.1 mL·g-1的比例混勻，再用水配制成所需濃度，對(duì)照為吐溫-80水溶液，濃度相當(dāng)于最高濃度藥液所加量。

受試害蟲(chóng)：粘蟲(chóng)卵購(gòu)自北京綻諾思特生物科技有限公司，經(jīng)26～28 ℃孵化，玉米嫩葉飼養(yǎng)。以帶藥葉片喂食試蟲(chóng)前，先進(jìn)行12 h饑餓處理。

受試病原菌：尖孢鐮刀菌是辣椒枯萎病的病原菌，為甘肅省科學(xué)院生物研究所農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究室從相應(yīng)的發(fā)病植株上采集、分離、鑒定和保存的。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1胃毒活性測(cè)定

采用葉片載毒法[14]對(duì)粘蟲(chóng)進(jìn)行胃毒活性的測(cè)定。選取直徑1.0 cm的無(wú)毒玉米葉片，用1.00 μL的微量點(diǎn)樣器在每一片葉上點(diǎn)涂0.50 μL的藥液，點(diǎn)涂丙酮作為對(duì)照，置于通風(fēng)處揮發(fā)掉溶劑后放入培養(yǎng)皿中(皿底鋪保濕濾紙，防止葉片干縮)，接入3 齡饑餓處理后的幼蟲(chóng)，每頭試蟲(chóng)給予一片載毒葉片。每組處理15頭試蟲(chóng)，3 次重復(fù)。24 h后取出載毒葉片，以新鮮葉片喂食。每天定時(shí)觀察、記錄，連續(xù)7 d。計(jì)算死亡率和校正死亡率。

1.2.2觸殺活性測(cè)定

采用點(diǎn)滴法[15]對(duì)粘蟲(chóng)進(jìn)行觸殺活性的測(cè)定。用微量點(diǎn)樣器將藥液點(diǎn)滴在試蟲(chóng)的前胸背板，每頭0.50 μL，每皿15頭試蟲(chóng)，3 次重復(fù)，丙酮作為對(duì)照，以新鮮玉米葉片喂食。于24 h后記錄死亡蟲(chóng)數(shù)、中毒癥狀，計(jì)算死亡率、校正死亡率。

1.2.3拒食活性測(cè)定

采用葉蝶法[15]對(duì)粘蟲(chóng)進(jìn)行拒食活性的測(cè)定。挑選直徑為1.0 cm新鮮玉米葉放入待測(cè)藥液中浸漬5 s取出, 對(duì)照組葉片以丙酮作相同處理。置于通風(fēng)處待丙酮自然揮發(fā)后，取處理和對(duì)照葉碟各一片平行放置于直徑5 cm的培養(yǎng)皿中，皿底內(nèi)墊保濕濾紙，每皿接入1 頭饑餓處理后的3 齡粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)，每處理15 頭試蟲(chóng)，重復(fù)3 次。24 h 后取出殘存葉片，用坐標(biāo)方格紙法測(cè)定取食面積，并據(jù)此計(jì)算試蟲(chóng)拒食率。

式中：SCK、S分別表示對(duì)照和處理組的取食面積。

1.2.4室內(nèi)毒力測(cè)定

采用浸葉法對(duì)粘蟲(chóng)進(jìn)行室內(nèi)毒力的測(cè)定。選取寬度、葉色等指標(biāo)基本一致的玉米葉片洗凈晾干后制成長(zhǎng)約1 cm的葉碟，浸入已配置好的不同濃度藥液中5 s，取出晾干，每個(gè)鋪有潮濕濾紙的培養(yǎng)皿中放置一片葉碟。選取大小及活力基本一致、且經(jīng)饑餓處理的3齡粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)各15頭，接在相同濃度藥液處理的葉碟上，每組處理重復(fù)3次。對(duì)照組喂食新鮮葉片。48 h后調(diào)查死亡蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算LC50值、相關(guān)系數(shù)及毒力回歸方程。

平心而論，“苛人寬己”是多數(shù)平凡人在生活中的常態(tài)。然而，遇到問(wèn)題時(shí)，“修身自省”才是處理好事情的關(guān)鍵所在。

1.2.5影響真菌病害病原菌菌絲生長(zhǎng)活性的測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[16]。取一定量植物提取物，加入到經(jīng)過(guò)121 ℃、25 min高溫滅菌的PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯培養(yǎng)基)中，使其成為含藥量為20、40、60、80、100 mg·mL-1的混合培養(yǎng)基。將此培養(yǎng)基倒入直徑90 mm的培養(yǎng)皿中制成含3種植物不同濃度提取物的平板。無(wú)菌條件下，用已滅菌的打孔器在尖孢鐮刀菌活化平板近邊緣處取直徑0.5 cm的菌絲塊，接種于含藥平板上，菌絲朝下，對(duì)照組為PDA培養(yǎng)基，26 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每組處理重復(fù)3次。計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率(MGI)。

式中：dc表示對(duì)照組菌絲平均生長(zhǎng)直徑；dt表示處理組菌絲平均生長(zhǎng)直徑。

1.2.6數(shù)據(jù)處理

所測(cè)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，測(cè)定結(jié)果采用“平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，用One-Way ANOVA中的Duncan法對(duì)同一植物提取物不同濃度間的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析以及多重比較，用Regression中的Probit計(jì)算LC50值；采用Excel 2019制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的胃毒活性

3種橐吾屬植物的提取物均對(duì)粘蟲(chóng)3齡幼蟲(chóng)表現(xiàn)出不同程度的胃毒活性(表1)，藏橐吾提取物對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的胃毒作用最強(qiáng)，提取物濃度在5 mg·mL-1時(shí)，粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的7 d累計(jì)校正死亡率均達(dá)到70.00%。黃帚橐吾提取物對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)有較強(qiáng)的胃毒活性，當(dāng)提取物濃度為20和10 mg·mL-1時(shí)，粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的7 d累計(jì)校正死亡率分別為97.62%和75.00%。箭葉橐吾提取物也對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)有一定程度的胃毒活性，當(dāng)提取物濃度為20和10 mg·mL-1時(shí)，粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的7 d累計(jì)校正死亡率僅分別為47.62%和41.43%，與其他濃度處理組之間差異極顯著(P＜ 0.01)。3種植物提取物對(duì)粘蟲(chóng)的胃毒LC50也顯示出藏橐吾提取物對(duì)粘蟲(chóng)的胃毒活性最強(qiáng)，為1.24 mg·mL-1，黃帚橐吾提取物和箭葉橐吾提取物對(duì)粘蟲(chóng)的胃毒LC50分別為2.32 和30.94 mg·mL-1。

表1 3種橐吾屬植物提取物對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的胃毒活性Table 1 Stomach toxic activity of the extracts from three species of Ligularia against Mythimna separata

2.2 提取物對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的觸殺活性

隨著3種橐吾屬植物提取物濃度的升高，粘蟲(chóng)的累計(jì)死亡率也隨之升高(表2)。藏橐吾提取物對(duì)3齡粘蟲(chóng)的觸殺活性較強(qiáng)，濃度在10 mg·mL-1以上時(shí)，粘蟲(chóng)的累計(jì)校正死亡率均在79%以上，且與其他低濃度處理組之間差異極顯著(P＜ 0.01)；當(dāng)濃度為20 mg·mL-1時(shí)，粘蟲(chóng)的校正死亡率達(dá)90.47%。黃帚橐吾提取物濃度為20 mg·mL-1時(shí)，粘蟲(chóng)校正死亡率達(dá)到87.76%，與其他處理組相比表現(xiàn)出極顯著差異(P＜ 0.01)。與其他兩種橐吾屬植物相較，箭葉橐吾提取物處理組的粘蟲(chóng)的死亡率和粘蟲(chóng)的觸殺活性略低。3種植物提取物對(duì)粘蟲(chóng)的觸殺LC50顯示：藏槖吾提取物的觸殺毒性略強(qiáng)于黃帚橐吾提取物，兩者的LC50分別為3.52和5.84 mg·mL-1，箭葉槖吾提取物的觸殺LC50為25.60 mg·mL-1，觸殺毒性最弱。

表2 3種橐吾屬植物提取物對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的觸殺活性Table 2 Contact toxicity of the extracts from three species of Ligularia against Mythimna separata

2.3 提取物對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的拒食活性

粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)對(duì)3種橐吾屬植物的提取物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的拒食活性(表3)，試蟲(chóng)在用藥24 h內(nèi)表現(xiàn)出明顯的拒食行為。提取物濃度高于2.5 mg·mL-1時(shí)，3種槖吾屬植物提取物對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的拒食率均大于60%。當(dāng)提取物濃度高時(shí)(≥10 mg·mL-1)，試蟲(chóng)幾乎不再進(jìn)食，試蟲(chóng)拒食率極顯著(P＜ 0.01)高于低濃度處理組(＜ 10 mg·mL-1)，同時(shí)高濃度處理組取食面積均等于或低于0.04 cm2，低濃度處理組取食面積均等于或大于0.15 cm2，差別甚大。

表3 3種橐吾屬植物提取物對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的拒食活性Table 3 Antifeedant activity of the extracts from three species of Ligularia against Mythimna separata

2.4 提取物對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒力比較

隨著濃度升高，3種橐吾屬植物提取物對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒力呈上升趨勢(shì)(圖1)。3種植物中藏橐吾提取物的毒力較強(qiáng)，其濃度在2.5 mg·mL-1以上時(shí)，試蟲(chóng)的校正死亡率均在60%以上。黃帚橐吾提取物濃度為20 mg·mL-1時(shí)，試蟲(chóng)的死亡率與藏橐吾提取物相應(yīng)濃度處理組的死亡率基本相同，其余濃度處理組的試蟲(chóng)死亡率均在40%以上。箭葉橐吾提取物的毒力相對(duì)較弱。分析顯示，藏橐吾提取物的LC50為1.067 mg·mL-1，黃帚橐吾提取物的LC50為1.851 mg·mL-1，箭葉橐吾提取物的LC50為27.957 mg·mL-1。

圖1 3種橐吾屬植物提取物對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒力Figure 1 The toxicity of extracts from three species of Ligularia against Mythimna separata

2.5 提取物對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制

3種提取物對(duì)尖孢鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)都具有極顯著的抑制作用，且抑制程度隨著提取物濃度升高而上升(圖2)。3種橐吾屬植物提取物抑制菌絲生長(zhǎng)的能力與其殺蟲(chóng)效力類(lèi)似，也表現(xiàn)為藏橐吾 ＞ 黃帚橐吾 ＞ 箭葉橐吾。

圖2 3種橐吾屬植物提取物對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制Figure 2 The inhibition activity of extracts from three species of Ligularia against mycelial growth of F. oxysporum

3 討論

黃帚橐吾、箭葉橐吾和藏橐吾廣泛存在于甘南的退化草地中[17-19]，已成為當(dāng)?shù)夭莸赝嘶臉?biāo)志之一[20]。本研究以綜合開(kāi)發(fā)利用的角度，從毒殺農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)和抑制植物病原菌兩個(gè)方面，對(duì)這3種植物提取物的生物農(nóng)藥活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明上述3種植物具有較大的生物農(nóng)藥開(kāi)發(fā)潛力。

3種橐吾屬植物提取物對(duì)玉米粘蟲(chóng)的毒殺作用方式基本一致，最強(qiáng)的作用方式是胃毒和拒食活性，觸殺活性也較強(qiáng)，該結(jié)果與劉錦霞等[1]的研究結(jié)果一致。此結(jié)果表明后續(xù)開(kāi)發(fā)上述3種橐吾屬植物提取物為主要原料的生物農(nóng)藥時(shí)，應(yīng)充分考慮制劑的吸附性和滲透性[21]，一方面制劑應(yīng)能較長(zhǎng)時(shí)間吸附在植物表面，以便能充分發(fā)揮農(nóng)藥對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)的拒食及胃毒活性；另一方面制劑良好的滲透性可以使藥劑在接觸到目標(biāo)害蟲(chóng)的身體時(shí)，能夠迅速發(fā)揮其觸殺活性。另外，施藥方式應(yīng)為葉面噴施，以保證藥劑與植物大面積充分接觸。

3種橐吾屬植物提取物的毒力強(qiáng)弱表現(xiàn)為藏橐吾 ＞ 黃帚橐吾 ＞ 箭葉橐吾，其作用方式基本一致，說(shuō)明3種植物之間可以進(jìn)行資源互補(bǔ)。本研究室(甘肅省科學(xué)院生物研究所農(nóng)業(yè)生物技術(shù)室)之前的研究對(duì)象集中在黃帚橐吾[1,9]，這主要是因?yàn)辄S帚橐吾在甘南退化草地中的分布最為廣泛、危害最為嚴(yán)重，因此將其作為資源植物開(kāi)發(fā)的首選。Guo等[22]和四朗玉珍等[23]對(duì)藏橐吾提取物的抑菌活性進(jìn)行了初步研究，均發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抑菌作用，但受試菌僅限于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。本研究結(jié)果表明藏橐吾提取物對(duì)于尖孢鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)具有3種橐吾屬植物提取物中最強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性，說(shuō)明藏橐吾可以作為很好的候補(bǔ)資源或復(fù)配資源，具有極大的研究和開(kāi)發(fā)潛力。

3種植物提取物作用于粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)時(shí)，蟲(chóng)體大多在12 h內(nèi)表現(xiàn)出不動(dòng)、不食的麻痹狀態(tài)，而后經(jīng)過(guò)興奮期，逐漸恢復(fù)，由此推測(cè)植物提取物可能首先作用于試蟲(chóng)的神經(jīng)系統(tǒng)或消化系統(tǒng)發(fā)揮其活性。無(wú)論哪種供試植物提取物，試蟲(chóng)的較高死亡率均出現(xiàn)在用藥后的48 h內(nèi)，也觀察到24 h內(nèi)試蟲(chóng)死亡的現(xiàn)象，這可能與提取物中含有某些高效活性物質(zhì)能夠迅速發(fā)揮作用有關(guān)。高效活性物質(zhì)的存在與否及其能夠迅速發(fā)揮作用的機(jī)理都有待進(jìn)一步的研究。更值得注意的是，3種植物皆為橐吾屬，且作用方式類(lèi)似，是否因?yàn)槟撤N或某些橐吾屬植物特有或共有的化學(xué)物質(zhì)在發(fā)揮活性作用，這也有待于進(jìn)一步深入研究。