李詩言，周欽，柯慶青，王鼎南，周凡，貝亦江，吳洪喜，丁雪燕，王揚

(浙江省漁業(yè)檢驗檢測與疫病防控中心， 浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站， 浙江 杭州 310023)

五氯酚(Pentachlorophenol，PCP)化學性質(zhì)穩(wěn)定，其鈉鹽五氯酚鈉(Sodium pentachlorophenol，PCP-Na)曾作為高效的除草劑、殺蟲劑和木材防腐劑在世界范圍內(nèi)被廣泛使用，PCP和PCP-Na已經(jīng)成為環(huán)境中一種常見的持久性有機污染物[1-3]。PCP-Na進入生物體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為PCP，而PCP具有較為復雜的復合生理毒性，包括致癌性、內(nèi)分泌毒性和遺傳毒性等[4-5]，2019年12月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第250號公告[6]，進一步規(guī)定了食品動物中不得檢出PCP-Na。PCP及PCP-Na作為一種難降解的有機污染物，可以通過食物鏈傳遞在生物體內(nèi)富集，引發(fā)潛在的食品安全問題，且近幾年水產(chǎn)品中PCP-Na殘留的報道時有發(fā)生[7-10]，因此長期開展水產(chǎn)品中PCP及其鈉鹽殘留的監(jiān)測非常必要。

動物源性食品中PCP-Na(以PCP計)的檢測方法報道較多，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)因特異性強，靈敏度高，且前處理無需衍生，已經(jīng)成為動物源性食品中PCP-Na殘留的主要檢測方法[11-13]。目前，關(guān)于動物源性食品中PCP-Na的樣品前處理手段主要采用傳統(tǒng)的固相萃取(Solid phase extraction, SPE)方法，該類前處理步驟繁瑣，易受復雜基質(zhì)特別是高脂基質(zhì)樣品的干擾[14]。相比其他動物源性食品，水產(chǎn)品物種跨度大，基質(zhì)差異性明顯，對檢測方法適用性要求更高。Captiva EMR-Lipid(以下簡稱EMR)小柱可通過體積排阻和疏水作用吸附脂類等長鏈物質(zhì)達到凈化目的，操作步驟簡便，基質(zhì)適用性較強，已經(jīng)成功在動物源性樣品的藥物殘留和毒素檢測中得到應用[15-16]。本試驗以EMR小柱為凈化手段，建立了水產(chǎn)品中PCP-Na(以PCP計)的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，并對包括中華鱉(Trionyxsinensis)和海水貝類在內(nèi)的水產(chǎn)品基質(zhì)進行驗證，以滿足水產(chǎn)品多種基質(zhì)中PCP-Na快速檢測工作的需要。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

實驗儀器主要包括：ExionLCTMAD超高效液相色譜儀(美國 SCIEX 公司)；4500 Qtrap 三重四級桿質(zhì)譜儀(美國 SCIEX 公司)；Multi Reax振蕩器(德國 Heidolph 公司)；Allegra X-12高速離心機(美國 BECKMAN 公司)；N-EVAP112水浴式氮吹濃縮儀(美國Organomation Associates 公司)。

實驗中用到的標準物質(zhì)包括：五氯酚鈉標準溶液(100 μg/mL，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所)；13C6-五氯苯酚標準品(純度≥97%，F(xiàn)irst Standard 公司)。

實驗中用到的主要耗材及試劑包括：乙腈、甲醇(LC-MS級，美國 Fisher 公司)；甲酸、乙酸、甲酸銨(HPLC級，美國Fisher 公司)；無水硫酸鎂(分析純，上海麥克林生化科技有限公司)；EMR凈化小柱(500 mg/3 mL，美國Agilent公司)。

1.2 樣品制備

待測樣品由浙江省內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)提供，品種為蝦類、鱉類、魚類、貝類和蟹類。其中，蝦類樣品去殼后取肌肉組織，鱉類樣品取主體軀干部分去殼去內(nèi)臟后取可食組織，魚類樣品帶皮取肌肉組織，貝類樣品瀝干后去殼取可食組織，蟹類樣品去背殼后取可食肌肉組織及性腺(蟹黃)部分，所有粗樣均放入攪拌機中制為勻漿狀，-20 ℃凍藏備用。

1.3 樣品前處理

提取試劑及提取方法的選擇：PCP的pka為4.9，呈弱酸性，因此可以根據(jù)實驗需要選擇酸性或者堿性溶劑進行提取。試劑為堿性環(huán)境時PCP為離子態(tài)，提取液可以直接兼容陽離子交換小柱進行上樣，試劑為酸性環(huán)境時PCP為分子態(tài)，易被乙腈等有機試劑萃取。本研究參照王連珠等[14]的方法，選擇1% 乙酸酸化乙腈作為提取溶液，之后進一步驗證了不同體積(5 mL、10 mL、15 mL和20 mL)提取液在6種水產(chǎn)品基質(zhì)(大口黑鱸(Micropterussalmoides)、大黃魚(Larimichthyscrocea)、縊蟶(Sinonovaculaconstricta)、中華鱉(TrionyxSinensis)、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)和青蟹(Scylla)，下同)中對PCP的單次提取效果(稱樣量為2.00 g)，以確定最優(yōu)的提取條件。

EMR小柱上樣溶液的選擇：EMR小柱主要通過體積排阻和疏水作用吸附脂類等長鏈物質(zhì)達到凈化目的，這類通過吸附干擾物的通過式SPE凈化方式相比“上樣、淋洗、洗脫”三步法SPE凈化方式更為便捷高效。EMR小柱通常采用乙腈/水溶液體系作為上樣溶液[16]，且需要優(yōu)化上樣溶液有機相比例以獲取最佳凈化條件。本研究考察了6種水產(chǎn)品基質(zhì)下，不同乙腈體積分數(shù)的上樣溶液(50%乙腈溶液～95%乙腈溶液，以5%比例遞增)經(jīng)EMR小柱凈化后對PCP絕對回收率的影響。

優(yōu)化后提取方法：準確稱取2.00 g樣品(精確至0.01 g)置于50 mL帶蓋離心管中，分別加入100 μL 1 mg/L的五氯酚-13C6同位素內(nèi)標工作液和1.0 g無水硫酸鎂，混勻后加入10 mL 1%乙酸乙腈溶液(v/v)，漩渦振蕩提取5 min后再超聲提取5 min，之后以8 000 r/min離心5 min，移取全部上清液于新的50 mL離心管中，再向樣品離心管中加入10 mL 1%乙酸乙腈溶液(v/v)重復上述步驟提取一次，合并所有上清液于40 ℃下氮吹至近干(不能吹干)，加入2 mL的75%乙腈水(v/v)溶液復溶，待凈化。

優(yōu)化后凈化方法：樣品復溶液漩渦振蕩1 min后全部移至5 mL Eppendorf離心管中，在4 ℃下14 000 r/min低溫高速離心10 min，取全部上清液過EMR小柱凈化。所有樣品溶液過柱后再用0.5 mL 75%乙腈水(v/v)溶液潤洗EMR小柱，收集所有流出液并過0.22 μm有機濾膜于進樣小瓶，待上機。

1.4 LC-MS/MS條件

1.4.1 色譜條件

為對色譜方法的流動相進行優(yōu)化，本研究考察了甲醇和乙腈流動相體系對于PCP色譜行為的影響，并篩選了不同品牌的C18色譜柱。優(yōu)化后色譜條件為：色譜柱為ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相A為5 mmol/L甲酸銨，流動相B為甲醇；柱溫為40 ℃；流速為0.3 mL/min；進樣量為2 μL。梯度洗脫程序：0～0.50 min，25%B；0.50～4.00 min，25%～100%B；4.00～6.00 min，100%B；6.00～6.10 min，100%～25%B；6.10～8.00 min，25%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源模式為ESI-，離子源溫度550 ℃，電噴霧電壓-4 500 V，霧化氣(GS1)壓力345 kPa，輔助氣(GS2)壓力379 kPa，氣簾氣(CUR)壓力172 kPa，掃描方式為多反應監(jiān)測(MRM)模式，具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.5 數(shù)據(jù)分析和計算

所有平行實驗均重復測定6次，數(shù)據(jù)以平均值表示?；|(zhì)效應計算公式如下：基質(zhì)效應(%)=[(基質(zhì)匹配標準曲線斜率/純?nèi)軇藴是€斜率)-1]×100%。絕對回收率計算公式如下：絕對回收率(%)=[(加標樣品經(jīng)凈化處理后待測藥物的峰面積/與加標樣品同等濃度的純試劑溶液待測藥物峰面積)]×100%。

表1 目標化合物的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrometric parameters for target compounds

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

采用針泵注射，對13C6-PCP和PCP-Na進行一級質(zhì)譜全掃描。結(jié)果表明13C6-PCP和PCP-Na在負源條件下響應較高，能夠分別形成含有4個同位素峰的[M-H]-和[M-Na]-準分子離子峰簇，豐度比接近3∶5∶3∶1。

以PCP-Na為例，進一步對其4個同位素離子峰(m/z262.7、m/z264.7、m/z266.7和m/z268.7)進行二級質(zhì)譜碎裂分析，發(fā)現(xiàn)上述離子的主要碎片離子均為[Cl]-，且存在m/z35.0和m/z37.0兩個同位素峰(m/z262.7離子除外)，因此選擇[M-Na]-> [Cl]-作為MRM模式的待優(yōu)化離子對，并對所有7個離子對組合的碰撞能量進行了優(yōu)化(見圖1)。結(jié)果表明7個離子對的最優(yōu)碰撞能量條件均為-50 eV，m/z264.7>35.0離子對的豐度是最高的，其次為m/z262.7>35.0 離子對，這與陳曉紅等[17]的研究結(jié)果基本一致。因此本研究最終選擇上述兩個離子對分別作為定量和定性離子對，以兩個不同母離子對應子離子的情況獲得5個識別點滿足歐盟2006/657/EC決議[18]對LC-MS/MS分析方法的定性要求。13C6-PCP質(zhì)譜規(guī)律與PCP-Na基本一致，優(yōu)化后的具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖1 碰撞能量對五氯酚離子對響應強度的影響Fig.1 The influence of collision energy on the intensity response of pentachlorophenol ion pair

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相的確定

試驗結(jié)果表明，相比乙腈流動相體系，PCP在甲醇流動相體系中出峰時間更遲，質(zhì)譜響應值更高。同時，在水相中加入緩沖鹽(甲酸銨)可有效改善目標化合物的峰形，穩(wěn)定出峰時間，防止峰漂移情況的出現(xiàn)。因此最終本研究采用甲醇作為有機相，5 mmol/L 甲酸銨為水相，反復試驗后確認1.4.1節(jié)中所描述的梯度洗脫程序。

2.2.2 色譜柱的選擇

PCP疏水性較強，大部分研究報道通常采用C18色譜柱作為分析柱[14-15]。不同品牌的C18色譜柱由于在硅膠純度、鍵合和雜化技術(shù)等生產(chǎn)工藝存在區(qū)別，導致其保留性能和選擇性存在不同進而影響目標物在質(zhì)譜分析中的靈敏度。本研究發(fā)現(xiàn)不同品牌的C18色譜柱對PCP的保留能力具有差異性，且PCP出峰時間越遲其質(zhì)譜響應越強。在研究組實驗室現(xiàn)有條件下，ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色譜柱分析PCP時保留能力最強，具有最高的質(zhì)譜響應，因此最終被選為色譜分析柱。

2.3 樣品品種的選擇

選擇縊蟶、羅氏沼蝦、大口黑鱸、中華鱉、大黃魚和青蟹共6種基質(zhì)作為檢測對象。相比標準方法[19]，本研究新增貝類和龜鱉類樣品基質(zhì)并兼顧高脂和低脂魚類，保證了方法在水產(chǎn)品中的廣泛適用性。

2.4 前處理條件的優(yōu)化

2.4.1 提取溶劑及提取方式的選擇

采用1%乙酸酸化乙腈溶液作為PCP的提取試劑，相比堿化乙腈，提取后溶液更為清澈干凈。生物樣品中的PCP部分以結(jié)合態(tài)存在，因此本研究在用酸化乙腈溶液提取后，進一步采用超聲輔助酸解，同時加入無水硫酸鎂吸附水分，以增加乙腈的萃取效率。同時，乙腈良好的沉淀蛋白效果使得提取液中主要的干擾物質(zhì)為脂類等弱極性化合物，有利于后續(xù)EMR小柱的針對性凈化。

PCP的提取效率驗證實驗參照1.3節(jié)進行，結(jié)果(見表2)表明10 mL提取液即可在6種水產(chǎn)品基質(zhì)中滿足PCP 70%以上的提取效率，再增加提取液體積對平均提取效率增加不明顯。之后，對提取試劑的提取次數(shù)進行了驗證，實驗結(jié)果表明重復提取2次和3次后平均提取率分別增加5%和7%，為了保證實際樣品中結(jié)合態(tài)PCP的提取效率，本研究最終采用兩次重復提取方式。

表2 不同體積提取液的提取效率驗證結(jié)果Tab.2 The results of extraction efficiency by the extraction reagent with different volumes

2.4.2 EMR小柱上樣溶液的確定

EMR小柱的上樣溶液比例驗證實驗參照1.3節(jié)進行，結(jié)果表明(見圖2)大黃魚和大口黑鱸基質(zhì)以80%乙腈溶液上樣凈化效果最好，絕對回收率平均值分別為77.1%和74.9%；縊蟶、中華鱉、羅氏沼蝦和青蟹基質(zhì)使用75%乙腈溶液上樣達到最優(yōu)效果，絕對回收率平均值分別為68.2%、78.7%、79.1%和52.3%。考慮到青蟹和縊蟶的回收率整體偏低，同時大黃魚和大口黑鱸基質(zhì)在采用75%乙腈溶液上樣后回收率仍有70%以上，本方法最終選擇75%乙腈水溶液作為EMR小柱的上樣溶液。

圖2 6種水產(chǎn)品基質(zhì)下不同比例乙腈上樣溶液對五氯酚回收率的影響Fig.2 Effects of acetonitrile solution with different volume fraction on the recovery of pentachlorophenol in six kinds of aquatic products

2.5 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應是質(zhì)譜分析中影響檢測準確度和靈敏度的重要因素[20]，本研究采用同位素內(nèi)標法對基質(zhì)效應進行校正，并對6種水產(chǎn)品基質(zhì)的基質(zhì)效應進行了考察。結(jié)果表明(見表3)除了青蟹表現(xiàn)為中等強度基質(zhì)效應(20%≤|ME|≤50%)，其余基質(zhì)均為弱基質(zhì)效應(|ME|<20%)。青蟹樣品由于含有大量蟹黃組織凈化負擔大，因此基質(zhì)效應相對較強，但通過EMR小柱的凈化和同位素內(nèi)標法的校準，本方法定性和定量均具有良好的準確性和穩(wěn)定性。

表3 6種基質(zhì)中五氯酚的基質(zhì)效應、回收率和相對標準偏差Tab.3 Matrix effects (ME), recoveries and relative standard deviations (RSDs) in six kinds of matrices n=6

2.6 方法學確證

采用同位素內(nèi)標法配置校準溶液，以PCP的定量離子對峰面積與相應同位素內(nèi)標峰面積的比值(y)為縱坐標，質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標做6個濃度水平的內(nèi)標定量工作曲線，該工作曲線的線性范圍為0.5～100.0 μg/L，線性方程為y=0.009 14x+0.004 05，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 5。如表3所示，6種基質(zhì)中PCP的加標回收率為89.6%～103.0%，相對標準偏差為4.39%～12.2%(見表3)。在0.5 μg/kg 水平標準添加時，上述6種基質(zhì)中PCP的信噪比S/N最低為16，符合相關(guān)法規(guī)要求，最終確認本方法的定量限為0.5 μg/kg。

2.7 實際樣品分析

采用本方法對15批次縊蟶、21批次羅氏沼蝦、18批次大口黑鱸、40批次中華鱉、33批次大黃魚和15批次青蟹進行分析，其中1批次中華鱉檢出PCP殘留(見圖3)，含量為0.86 μg/kg，其余樣品均未檢出PCP。采用標準方法[19]及研究組之前依據(jù)標準優(yōu)化過的實驗方法[21]對該陽性樣品進行檢測，其檢出值分別為0.76 μg/kg和0.91 μg/kg，可見本方法準確可靠。

圖3 中華鱉陽性樣品的MRM色譜圖Fig.3 The extracted ion chromatography for positive samples of Trionyx sinensis under MRM mode

3 結(jié)論

本研究建立了EMR小柱凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定水產(chǎn)品中痕量PCP及其鈉鹽的方法。相比標準方法，本方法采用EMR小柱的通過式固相萃取模式進行凈化，進一步縮短了前處理時間。經(jīng)驗證，本方法測定結(jié)果準確、可靠，技術(shù)指標滿足水產(chǎn)品中PCP-Na的殘留分析及法規(guī)要求。