張強， 羅彩云， 孫達(dá)權(quán)， 曾志銳， 鄭志菊， 徐國強,3**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴陽市第二人民醫(yī)院 手術(shù)室， 貴州 貴陽 550023； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)研究中心， 貴州 都勻 558000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常見的原發(fā)性肝癌，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大主要原因[1-3]。手術(shù)切除是根治性治療肝癌最常見的方法，但是術(shù)后5年生存率并不理想，根本原因在于手術(shù)切除后腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的幾率很高[4-5]。因此，更好地了解肝癌增殖及凋亡的分子機制對預(yù)防肝癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移具有重要意義。Nedd4家族交互作用蛋白2(nedd4 family interacting protein 2,Ndfip2)是Nedd4家族交互作用蛋白中的一員,可與Nedd4家族蛋白的 WW 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，能夠激活E3泛素蛋白連接酶中Nedd4家族成員[6]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，Ndfip2通過PTEN/Akt信號通路、MAP激酶信號通路等調(diào)控細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[7-8]，然而Ndfip2基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響仍舊不清楚。因此，為了進一步探究Ndfip2對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響，本實驗通過沉默Ndfip2在肝癌細(xì)胞SMMC-7721和HepG2中的表達(dá)，觀察Ndfip2低表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

人正常肝細(xì)胞株LO2、人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、HepG2購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫， RPMI-1640培養(yǎng)基和青-鏈霉素購自美國HyClone公司，新生牛血清(FBS) 購自四季青公司，二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司，Ndfip2-siRNA序列由上海吉瑪基因公司合成。LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京索萊寶生物公司，BCA蛋白濃度定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司，RIPA裂解液和PMSF酶抑制劑購自武漢博士德生物公司，PVDF膜購自Millipore公司，高敏ECL曝光液購自上海碧云天生物技術(shù)公司，兔抗人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)多克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗人Nedd4家族交互作用蛋白2(nedd4 family interacting protein 2，Ndfip2)多克隆抗體購自美國Affinity公司，兔抗人磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、兔抗人磷酸化Akt (Ser473) [phospho-Akt(Ser473)，p-Akt(S473)]、兔抗人蛋白激酶B(protein kinase B，PKB、又稱為Akt) 、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1, MMP-1)、兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、鼠抗人Bcl2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bcl2-associated X protein，Bax) 、兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl2)多克隆抗體購自武漢三鷹公司，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體購自巴傲得生物科技有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗鼠IgG(二抗)購自武漢三鷹公司，CCK-8試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人正常肝細(xì)胞株LO2、人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721及HepG2，在37 ℃、5%培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合率70%～80%時，用0.25%胰酶消化并傳代、進行后續(xù)的實驗，此3種細(xì)胞均為貼壁生長。

1.2.2si-RNANdfip2沉默細(xì)胞株的構(gòu)建 將細(xì)胞按1×106個/孔，鋪于12孔板待長到50%～70%時對細(xì)胞進行瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前2 h將12孔換成新鮮無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，取siRNA(1D)，瞬時離心后加入125 μL DEPC處理水配成工作溶液。取兩個1.5 mL離心管，一管加入4 μL Lipo2000與200 μL 無血清RPMI-1640培養(yǎng)基后混勻，另一管加入4 μL siRNA與無血清200 μL RPMI-1640培養(yǎng)基后混勻、室溫靜置5 min；混勻上述兩個離心管中的液體，室溫靜置20 min，實驗組中每孔各加入204 μL混合液，然后每孔補充796 μL 無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后換成含20 % FBS的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染完成后，采用蛋白印跡法檢測轉(zhuǎn)染效率。Ndfip2特異性si-RNA的正義鏈序列為5′-GGAAGAGUGUCCACCAACATT-3′，反義鏈序列為5′-UCUUGGUGGACACUCU- UCCTT-3′，陰性對照的正義鏈序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，反義鏈序列為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′。

1.2.3實驗分組 SMMC-7721細(xì)胞分為Ndfip2-siRNA沉默對照組(NC)和Ndfip2沉默組(si-Ndfip2)，HepG2細(xì)胞分為Ndfip2-siRNA沉默對照組(NC)和Ndfip2沉默組(si-Ndfip2)。

1.2.4CCK-8實驗檢測肝癌細(xì)胞的增殖能力 將轉(zhuǎn)染完成的各組細(xì)胞按每孔5×103個細(xì)胞懸液接種于96 孔板中，使用CCK-8 試劑盒檢測細(xì)胞增殖，每組3個或以上復(fù)孔，在0、24、48 h時分別按照試劑說明書加入CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h后酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞450 nm處的吸光度。計算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率(%)=[(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)] ×100%。

1.2.5平板克隆形成實驗檢測肝癌細(xì)胞的增殖能力 將轉(zhuǎn)染完成的各組細(xì)胞接種于6孔板，每孔細(xì)胞為1 000個，常規(guī)培養(yǎng)10～12 d，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的克隆集落時終止培養(yǎng)；棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖洗1～2次，加入4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 min，然后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min；棄去染料，用PBS進行沖洗，在自然光狀態(tài)下拍照、并進行計數(shù)統(tǒng)計分析。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測肝癌細(xì)胞凋亡能力 將轉(zhuǎn)染完成的各組細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化后，進離心2 000 r/min 、4 ℃ 5 min；棄去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后4 ℃離心2 000 r/min 5 min；收集細(xì)胞，用移液槍吸盡PBS，然后加入100 μL的1×Binding buffer，將細(xì)胞重懸，接著依次加入Annexin V-FITC 5 μL和PI Staining Solution 10 μL，輕輕震蕩混勻。避光，反應(yīng)約15 min，最后加入1×Binding buffer 400 μL、混勻并放置于冰上，流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的凋亡能力。

1.2.7蛋白印跡法(Western blot)檢測肝癌細(xì)胞中Ndfip2、凋亡相關(guān)蛋白(Caspase3、Bax、Bcl2)以及PTEN-PI3K/Akt通路蛋白[PTEN、PI3K、Akt、p-Akt(S473)、MMP1]的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，經(jīng)RIPA裂解液裂解，使用BCA定量法進行定量，配制10%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，每孔蛋白上樣量為10 μL；后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，37 ℃、5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜(1×TBST，3次，5 min/次)，二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔(稀釋度均為1 ∶2 000)]室溫孵育2 h，洗膜，在膜上均勻鋪上曝光液ECL，在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)測定結(jié)果；用Quantity One系統(tǒng)分析目的條帶并獲取目的條帶的灰度值進行分析。本實驗使用GAPDH作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參，用目的蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白的灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量，p-Akt(S473)蛋白相對表達(dá)量為p-Akt(S473)蛋白條帶灰度值與總Akt蛋白條帶灰度值的比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Ndfip2的表達(dá)水平

結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞LO2組比較，Ndfip2在肝癌細(xì)胞SMMC-7721組、HepG2組中表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與LO2組比較，P<0.05。圖1 Ndfip2在正常肝細(xì)胞LO2、肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和HepG2組中的表達(dá)Fig.1 Ndfip2 expression levels in normal liver cell line LO2, HCC lines SMMC-7721, and HepG2

2.2 Ndfip2 siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株

結(jié)果顯示，si-Ndfip2組SMMC-7721和HepG2細(xì)胞中的Ndfip2的表達(dá)水平較NC組細(xì)胞下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示Ndfip2低表達(dá)肝癌細(xì)胞構(gòu)建成功。見圖2。

注：(1)與NC組比較，P<0.05。圖2 構(gòu)建Ndfip2低表達(dá)細(xì)胞株Fig.2 Construction of silencing Ndfip2 expression in HCC lines

2.3 沉默Ndfip2對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實驗(圖3A)結(jié)果顯示，與NC組比較，48 h時SMMC-7721和HepG2細(xì)胞si-Ndfip2組D值均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。平板克隆形成實驗(圖3B、C)結(jié)果顯示，si-Ndfip2組的SMMC-7721和HepG2細(xì)胞克隆形成數(shù)低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注:A為CCK-8實驗結(jié)果，B、 C為平板克隆形成實驗結(jié)果；(1)與NC組比較，P<0.05。圖3 沉默Ndfip2對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of silencing Ndfip2 on HCC proliferation

2.4 沉默Ndfip2對肝癌細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的影響

流式細(xì)胞儀(圖4A、B)結(jié)果表明，與NC組比較，si-Ndfip2組細(xì)胞凋亡率上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Western blot(圖4C、D、E、F)結(jié)果顯示，與NC組比較，si-Ndfip2組中Caspase3和Bax蛋白表達(dá)量上調(diào)，而Bcl2表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注：A為兩組細(xì)胞凋亡水平結(jié)果，B為兩組細(xì)胞凋亡水平定量結(jié)果，C、E為條帶灰度結(jié)果，D、F為相對定量結(jié)果；(1)與NC組比較，P<0.05。圖4 沉默Ndfip2對肝癌細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig.4 Effect of silencing Ndfip2 on the apoptosis rate and the expression levels of apoptosis-related proteins in HCC lines

2.5 沉默Ndfip2對肝癌細(xì)胞中PTEN-PI3K/Akt信號通路的影響

Western blot(圖5)結(jié)果顯示，與NC組比較，si-RNA組SMMC-7721和HepG2細(xì)胞中的PI3K、p-Akt(S473)和MMP1蛋白表達(dá)水平下調(diào)，而PTEN水平則升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注：A、C為條帶灰度結(jié)果，B、D為相對定量結(jié)果；(1)與NC組比較， P<0.05。圖5 沉默Ndfip2對肝癌細(xì)胞中PTEN-PI3K/Akt信號通路的影響Fig.5 Effect of silencing Ndfip2 on PTEN-PI3K/Akt signaling pathway in HCC lines

3 討論

肝癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，目前來說肝移植是治療肝癌的主要方法，但是術(shù)后高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率嚴(yán)重影響其治療效果[9]。隨著生物信息學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了很多與術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的生物分子標(biāo)記物，對此類分子標(biāo)記物的研究有助發(fā)發(fā)現(xiàn)新的靶點，為肝癌的治療提供新的思路與方向[10-12]。近年來，泛素化的研究受到廣大研究者的關(guān)注，其中HECT型E3泛素連接酶由于其固有的酶促活性，以及能夠特異性識別蛋白底物而受到廣泛研究[13-14]，例如HECT型E3泛素連接酶的典型代表Nedd4亞家族，研究發(fā)現(xiàn)該家族成員在晚期胃癌、肺癌中均發(fā)生過表達(dá)，對腫瘤的生長與發(fā)展產(chǎn)生了重要的影響[15-16]。Ndfip2，全稱Nedd4家族相互作用蛋白2，是一種參與泛素化的多功能蛋白，因其可與Nedd4特異性結(jié)合，所以在泛素化過程中作為Nedd4蛋白家族成員的激活蛋白而存在[17]。最新研究發(fā)現(xiàn)NEDD4可通過下調(diào)胰腺癌細(xì)胞中PTEN的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，同樣在肝癌細(xì)胞中NEDD4通過調(diào)節(jié)LATS1(Hippo通路的腫瘤抑制因子)而促進肝癌細(xì)胞的增殖，抑制肝癌細(xì)胞的凋亡[18]。實驗通過CCK-8、平板克隆實驗和流式細(xì)胞術(shù)等實驗研究發(fā)現(xiàn)沉默Ndfip2可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，促進其凋亡能力，提示Ndfip2可能促進肝癌細(xì)胞的增殖，抑制肝癌細(xì)胞的凋亡。

PI3K/Akt信號通路是調(diào)節(jié)多種生物過程信號傳導(dǎo)的重要途徑，例如細(xì)胞生長、增殖和凋亡[19-20]。磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)是一種腫瘤抑制因子，也是PI3K的主要拮抗劑，研究發(fā)現(xiàn)在多種人類腫瘤中PTEN的缺失或失活將導(dǎo)致PI3K /Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過快，從而驅(qū)動腫瘤的發(fā)生，因此也被描述為癌癥的動力途徑之一[21-23]。Mund等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Ndfip2能夠通過調(diào)控PTEN而影響PI3K/Akt信號通路，最終影響細(xì)胞的增殖和凋亡活動。研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞SMMC-7721和HepG2中，沉默Ndfip2使得PI3K、p-Akt(S473)蛋白表達(dá)顯著降低，而PTEN表達(dá)水平則顯著升高，提示在肝癌細(xì)胞中，沉默Ndfip2可以抑制PTEN-PI3K/Akt信號通路的活化。凋亡機制的缺失也是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要因素之一， Bcl2、Bax和Caspase3是關(guān)系密切的3個凋亡相關(guān)蛋白，其中抗凋亡基因Bcl2與促凋亡基因 Bax均為Bcl2家族蛋白成員，Caspase3則作為凋亡執(zhí)行者而存在，參與多種因素誘導(dǎo)的凋亡[24-25]。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)在肝癌細(xì)胞SMMC-7721和HepG2中中沉默Ndfip2時，Caspase3和Bax蛋白表達(dá)顯著上升，而Bcl2卻顯著下降，提示沉默Ndfip2而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞SMMC-7721和HepG2凋亡能力的提升，可能與Bcl2/Bax通路有關(guān)。

綜上所述，沉默Ndfip2能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721和HepG2的增殖能力，促進其細(xì)胞的凋亡能力，其機制可能PTEN-PI3K/Akt的失活有關(guān)，這有助于能夠更好地理解肝癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程，為肝癌的臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。