陳俞如， 潘艷伶， 馬歡， 伏紅穎

(1.貴州醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院 中醫(yī)學教研室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 中醫(yī)科， 貴州 貴陽 550004)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種以肝細胞脂肪樣變?yōu)樘卣鞯某Ｒ娐源x性肝病，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是引起NAFLD的重要危險因素[1]。有研究表明，T2DM患者出現(xiàn)NAFLD的幾率高達60%，已成為臨床高發(fā)疾病，如未能對其采取及時有效的防治措施，可進展為肝硬化、肝纖維化，甚至導致肝癌發(fā)生[2-3]。目前，研究者們普遍認可胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是T2DM和NAFLD共同發(fā)病的基礎(chǔ)[4]，因此將改善IR作為治療該病的切入點意義重大。本課題組前期研究已表明，經(jīng)驗方糖通飲(簡稱糖通飲)可明顯改善T2DM大鼠IR并能顯著降低其血脂水平[5-7]，但其對T2DM合并NAFLD模型大鼠是否具有療效及機制尚不清楚。由于IR的發(fā)生發(fā)展與JNK通路的異常活化關(guān)系密切[8]，因此，本研究通過對T2DM合并NAFLD模型大鼠進行糖通飲干預，觀察大鼠相關(guān)指標的變化，探討糖通飲對T2DM合并NAFLD模型大鼠的治療作用及可能的機制，現(xiàn)將結(jié)果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 8周齡SPF級SD雄性大鼠44只，體質(zhì)量(180±20)g，購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司[SCXK(黔)2015-005]；大鼠自由飲食飲水，飼養(yǎng)溫度21～26 ℃，濕度40%～60%，避免噪音干擾，保持環(huán)境清潔，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2藥品及飼料 糖通飲飲片(生地12 g、黃芪15 g、山藥15 g、山茱萸15 g、茯苓15 g、丹皮10 g、丹參15 g、草決明15 g、澤瀉9 g及地骨皮15 g)由貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中藥房提供，高脂高糖飼料(普通飼料58%、精煉豬油20%、糖20%及膽固醇2%)由貴州醫(yī)科大學動物中心提供。

1.1.3主要試劑及儀器 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、血清胰島素(serum insulin，F(xiàn)INS)酶聯(lián)免疫(ELISA)測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，非酯化脂肪酸(nonesterifiedfatty acid，NEFA)測定試劑盒、甘油三酯(triglycerides，TG)含量測定試劑盒(南京建成生物公司)，蘇木素染液和伊紅染液(武漢賽維爾生物公司)，磷酸化c-Jun氨基末端激酶-1(phosphorylated JNK amino-terminal kinase-1，p-JNK1)、c-Jun氨基末端激酶-1(c-Jun N-terminal kinase-1，JNK1)及磷酸化胰島素受體底物-1(phosphorylated insulin receptor substrate-1，p-IRS-1)抗體(美國CST公司)，胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，β-肌動蛋白(β-actin)、辣根酶標記山羊抗兔二抗(HRP-labeled goat anti-rabbit IgG,上海艾比瑪特生物公司)；DM 4000B型倒置顯微鏡(德國Leica公司)，DR-200Bs型酶標儀(Diatek公司)及chemidoc型凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1造模及分組 隨機取10只大鼠作正常組，給予普通飼料喂養(yǎng)，注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。其余34只大鼠以高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后，禁食、不禁水12 h，予含1% STZ的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)小劑量多次腹腔注射以建立T2DM合并NAFLD大鼠模型；首次劑量為20 mg/kg，每隔72 h檢測1次空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，F(xiàn)BG<16.7 mmol/L者視為未達標，在首次劑量基礎(chǔ)上增加5 mg/kg劑量；待造模大鼠FBG>16.7 mmol/L時，則隨機從正常組及造模大鼠中各抽取2只大鼠進行蘇木精-伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE)染色，若光鏡下觀察到造模大鼠較正常組大鼠肝細胞內(nèi)存在明顯脂肪樣變性，則表明T2DM合并NAFLD造模成功[9]。取造模成功大鼠32只，采用隨機數(shù)字表法均分為模型組及糖通飲低、中、高劑量組，每組8只。

1.2.2藥物制備 將糖通飲飲片置于專用器皿中注入適量雙蒸水，浸泡30 min，熬制成煎劑，低劑量濃縮為含生藥0.6×103g/L的藥液，中劑量濃縮為含生藥1.2×103g/L的藥液，高劑量濃縮為含生藥1.8×103g/L的藥液，灌胃容積為20×10-3L/kg[10]。

1.2.3干預治療 根據(jù)成人與大鼠體表面積等效劑量比值表折算大鼠用藥劑量。糖通飲低、中、高劑量組分別按12 g/kg、24 g/kg、36 g/kg灌胃給藥，正常組及模型組予等容積雙蒸水灌胃，各組大鼠連續(xù)灌胃8周，1次/d。灌胃期間大鼠死亡6只，其中模型組及糖通飲低劑量組各死亡2只，糖通飲中、高劑量組各死亡1只。

1.2.4FBG、FINS檢測及相關(guān)指標計算 各組大鼠連續(xù)灌胃8周后，稱取體質(zhì)量，禁食、不禁水12 h，尾靜脈針刺采血約50 μL，使用血糖儀檢測FBG；按300 mg/kg予10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，于腹主動脈取血8 mL，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒方法進行測定備測FINS、游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)，并根據(jù)公式計算胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index，HOMA-IR)及胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)。具體公式如下：HOMA-IR=FBG×FINS/22.5；ISI=1/(FBG×FINS)[11]。

1.2.5肝臟指數(shù)計算 各組大鼠在1.2.4項下取血后迅速摘取肝組織，予生理鹽水洗凈，稱取大鼠肝臟濕質(zhì)量，計算肝臟指數(shù)(肝臟指數(shù)=肝臟濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)。

1.2.6HE染色法檢測肝組織形態(tài)學特征 取1.2.5項下各組大鼠部分肝組織，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、包埋、切片；切片于65 ℃烘箱烤40 min，二甲苯脫蠟，脫水，清洗；蘇木素染液染色5 min、清洗；分化液分化4 s，伊紅染色5 min，清洗、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并進行圖像采集及分析。

1.2.7肝組織TG含量檢測 取1.2.5項下各組大鼠部分肝組織，置于-80 ℃冰箱凍存，加無水乙醇勻漿0.9 mL，按試劑盒方法進行檢測肝組織TG含量。

1.2.8Western blot法檢測肝組織p-JNK1/JNK1、p-IRS-1/IRS-1蛋白的表達 取1.2.7項下各組大鼠部分肝組織，根據(jù)目的蛋白分子量大小分別制作8%和12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAG)凝膠，注入適量電泳緩沖液，置于4 ℃冰箱備用；取肝組織0.1 g，加裂解液1 mL，置于自動勻漿機中勻漿，靜置冰上20 min裂解，4 ℃下1 200 r/min離心20 min，取上清液；制備好的蛋白樣品采用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchonininc acid，BCA)法進行濃度測定，根據(jù)濃度加適量loading buffer置于沸水10～15 min；依次進行SDS-PAG凝膠電泳(300 mA轉(zhuǎn)膜 1.5～2 h)，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜置于5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，予TBST緩沖液洗膜后，再分別將膜置于加p-JNK1、JNK1、p-IRS-1及IRS-1抗體(1 ∶1 000)的孵育盒中、4 ℃搖床孵育過夜，次日予TBST緩沖液洗膜，加入二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h；將增強型化學發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)中魯米諾和過氧化氫按1 ∶1充分混勻，再將上述PVDF膜充分浸潤于以上配置好的混合液中，最后置于凝膠成像分析系統(tǒng)中進行觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 造模情況

正常大鼠肝細胞形態(tài)完整、排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰，造模大鼠肝細胞內(nèi)存在大小不等的脂肪空泡(圖1)，F(xiàn)BG>16.7 mmol/L，且FBG[(20.6±1.30)mmol/L]高于正常大鼠[(7.6±2.20)mmol/L]，差異有統(tǒng)計學意義(t=538.752，P=0.001)，提示T2DM合并NAFLD大鼠模型復制成功。見圖1。

注：黑色箭頭所示為脂滴空泡。圖1 正常大鼠和造模大鼠的肝組織染色(HE，×400)Fig.1 Staining of liver tissues in normal and model groups(HE，×400)

2.2 HOMA-IR和ISI水平

與正常組相比，模型組大鼠HOMA-IR升高、ISI降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，糖通飲各劑量組HOMA-IR降低、ISI增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；糖通飲各劑量組間HOMA-IR、ISI比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠HOMA-IR和ISI水平Tab.1 Levels of HOMA-IR and ISI in each group

2.3 血清FFA和TG水平

與正常組相比，模型組大鼠血清FFA、肝組織TG水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，糖通飲各劑量組大鼠血清FFA、肝組織TG水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；糖通飲各劑量組間血清FFA、肝組織TG水比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清FFA和肝組織TG水平Tab.2 Levels of serum FFA and liver TG in each group

2.4 肝臟指數(shù)

與正常組相比，模型組大鼠肝臟指數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，糖通飲各劑量組大鼠肝臟指數(shù)均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；糖通飲高劑量組大鼠肝臟指數(shù)分別較低、中劑量組下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠的肝臟指數(shù)Tab.3 Liver index of rats in each

2.5 肝臟組織學特征

正常組大鼠肝細胞形態(tài)正常，排列整齊，細胞核清晰可見；與正常組相比，模型組大鼠肝細胞排列不齊，存在明顯水腫、變性，細胞核脂滴空泡擠壓；與模型組相比，糖通飲各劑量組大鼠肝細胞內(nèi)脂滴數(shù)量減少，其中以高劑量組改善效果最佳。見圖2。

注：黑色箭頭所示為脂滴空泡。圖2 各組大鼠肝組織的染色結(jié)果(HE，×400)Fig.2 Staining of liver tissues in each group(HE，×400)

2.6 肝組織p-JNK1/JNK1和p-IRS-1/IRS-1蛋白的表達

與正常組相比，模型組大鼠肝組織p-JNK1/JNK1和p-IRS-1/IRS-1蛋白表達水平均增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，糖通飲各劑量組大鼠肝組織p-JNK1/JNK1和p-IRS-1/IRS-1蛋白表達水平均下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；糖通飲各劑量組大鼠肝組織p-JNK1/JNK1和p-IRS-1/IRS-1蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

注：A為p-JNK1、JNK1蛋白的Western blot檢測結(jié)果，B為p-JNK1/JNK1蛋白定量結(jié)果，C為p-IRS-1、IRS-1蛋白的Western blot檢測結(jié)果，D為p-IRS-1/IRS-1蛋白定量結(jié)果；(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。圖3 各組大鼠肝組織 p-JNK1/JNK1和p-IRS-1/IRS-1蛋白的表達Fig.3 Protein expression levels of p-JNK1/JNK1 and p-IRS-1/IRS-1 in rat liver tissues of each group

3 討論

IRS-1是細胞內(nèi)胰島素反應(yīng)的重要配體，胰島素受體底物可通過與胰島素受體鍵合，從而使胰島素發(fā)揮正常生理作用[12]。JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族重要成員之一，該通路通?？杀籉FA等因素特異性活化，被激活的JNK可通過與IRS-1結(jié)合，促使IRS-1絲氨酸位點發(fā)生磷酸化，從而阻止IRS-1與胰島素受體結(jié)合，進而影響胰島素下游信號通路正常表達，妨礙胰島素發(fā)揮其正常生理功能，最終誘導IR的發(fā)生[8,13]。當IR發(fā)生時，胰島素對脂肪代謝的調(diào)節(jié)作用減弱，脂肪分解能力增強，F(xiàn)FA在血液中大量產(chǎn)生，經(jīng)門靜脈途徑進入肝臟，在肝內(nèi)合成TG，并異常積聚于肝細胞內(nèi)，致使肝細胞出現(xiàn)腫脹、變性形成脂肪樣變[14]。目前，西醫(yī)治療T2DM合并NAFLD主要以增加胰島素敏感性及調(diào)脂為主，該類藥物可一定程度地延緩該病病情進展，但存在一定的毒副作用[15]；中醫(yī)藥在防治T2DM合并NAFLD的過程中收效顯著，且具備毒副作用小、治療成本低的優(yōu)勢。有研究表明，六味地黃丸、降脂湯、祛濕化瘀方等能明顯改善大鼠IR，減輕肝細胞脂肪變性，對肝組織具有一定的保護作用[16-18]。

祖國醫(yī)學雖未明確記載T2DM合并NAFLD病名，但根據(jù)臨床表現(xiàn)，可歸屬于“消渴”、“肥氣”、“肝著”等范疇。目前，眾醫(yī)家大多認可T2DM合并NAFLD為“本虛標實”[19-20]，“本虛”以氣陰兩虛為主，“標實”多為痰濁、瘀血阻滯。腎為人的先天之本，腎陰虧損致使水不涵木，肝陰不足，則氣郁化火煎灼津液，釀為痰濁，阻滯氣機，致使血液運行不暢形成瘀血，痰濁、瘀血積聚肝絡(luò)，最終導致T2DM合并NAFLD的發(fā)生。中藥方劑糖通飲是凌湘力教授在傳統(tǒng)方劑六味地黃丸的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗加以化裁而成，該方以具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津之效的生地黃作為君藥，輔以臣藥黃芪、山茱萸、山藥益氣養(yǎng)陰以治本，澤瀉、茯苓、丹皮、丹參、草決明及地骨皮共為佐使藥，祛瘀泄?jié)嵋灾纹錁?，諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰、祛瘀泄?jié)嶂5-7]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪多糖可通過改善胰島素抵抗及脂質(zhì)代謝異常，來減緩單純的非酒精性脂肪肝向非酒精性脂肪肝炎進展[21]；山藥多糖能顯著降低糖尿病大鼠血糖水平，提高其糖耐量、糖原和c肽含量，并可改善高脂大鼠血清TC、TG、LDL-C含量[22]；地骨皮可顯著改善T2DM大鼠IR及脂代謝異常，并可緩解肝細胞脂肪變性[23]；澤瀉提取物能有效減少高脂血癥小鼠肝組織中脂類物質(zhì)的過量沉積，且具有降低血脂水平及保護胰島細胞的作用[24]；丹參可通過降低血清中IL-6、IL-17、TNF-α水平,抑制RORγt基因表達，從而減輕NAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)沉積及炎癥損傷[25]。

本研究結(jié)果顯示，糖通飲可顯著降低T2DM合并NAFLD模型大鼠HOMA-IR及肝臟指數(shù)，增高ISI，減少血清FFA及肝組織TG含量，并減輕肝細胞脂質(zhì)沉積及脂肪變性程度，提示糖通飲對T2DM合并NAFLD模型大鼠存在的IR、肝細胞脂肪樣變、肝內(nèi)脂質(zhì)過量堆積的情況具有改善作用。本研究還表明，糖通飲可下調(diào)T2DM合并NAFLD模型大鼠肝組織中p-JNK1/JNK1、p-IRS-1/IRS-1蛋白的表達水平，揭示糖通飲對T2DM合并NAFLD模型大鼠的治療作用可能與良性調(diào)控肝組織中JNK信號通路相關(guān)蛋白表達有關(guān)。以上結(jié)果為臨床應(yīng)用糖通飲治療T2DM合并NAFLD提供了一定的理論依據(jù)。