何紅梅 余雄武 左奎 劉林燕 孫麗 李鳳瓊

摘要：目的：比較程序降溫儀冷凍法和液氮熏蒸法冷凍人類(lèi)精子復(fù)蘇及復(fù)蘇24小時(shí)后運(yùn)動(dòng)能力的差異。方法：對(duì)來(lái)自本院男科實(shí)驗(yàn)室50份精液標(biāo)本分別應(yīng)用程序降溫儀冷凍法和液氮熏蒸法分別進(jìn)行冷凍保存，液氮熏蒸法使用1.8ml和0.5ml兩種冷凍載體。復(fù)蘇后的精子以及復(fù)蘇后24小時(shí)的精子分別比較前向運(yùn)動(dòng)精子百分率（a+b級(jí)）%、快速前向精子百分率a%及曲線(xiàn)速率（VCL）、直線(xiàn)速率（VSL）、平均路徑速率（VAP）等參數(shù)。結(jié)果：應(yīng)用程序降溫法冷凍精子復(fù)蘇后（a+b級(jí)）%、a%及VCL、VSL、VAP等參數(shù)與液氮熏蒸法兩種冷凍載體復(fù)蘇后的精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)比較無(wú)顯著差異（ P>0.05）。程序冷凍法復(fù)蘇后精子經(jīng)上游處理24小時(shí)后前向運(yùn)動(dòng)精子百分率（a+b級(jí)）%、快速前向精子百分率（a級(jí)）%、VCL、VSL、VAP等參數(shù)與液氮熏蒸法各組參數(shù)比較無(wú)顯著性差異（P>0.05） 。結(jié)論：液氮熏蒸法冷凍人類(lèi)精液在存活率和運(yùn)動(dòng)能力等方面不遜于程序降溫儀冷凍法，兩者均適于人類(lèi)精液的冷凍保存。

關(guān)鍵詞：精液保存;程序冷凍法;液氮熏蒸法;上游法。

部分不孕患者在實(shí)施體外授精胚胎移植（in vitro fertilization，IVF）過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)取精極度困難或因個(gè)人因素（如女方取卵當(dāng)日男方無(wú)法來(lái)醫(yī)院取精的情況），對(duì)于這部分男性患者，提前冷凍保存一份精液可以作為取精日的備用選擇。程序冷凍法、液氮熏蒸法是常見(jiàn)的用于人類(lèi)精液冷凍保存的兩種方法。這兩種方法在精液冷凍復(fù)蘇過(guò)程中，都可能會(huì)形成冰晶，而冰晶形成過(guò)大或過(guò)多會(huì)不可避免地?fù)p傷精子結(jié)構(gòu)，影響精子的功能[1]，這會(huì)影響復(fù)蘇后精子的存活率和運(yùn)動(dòng)能力，而精液冷凍復(fù)蘇后的活率及運(yùn)動(dòng)能力是決定成功受精乃至臨床妊娠的重要因素[2]。為了比較程序冷凍法、液氮熏蒸法冷凍保存人類(lèi)精子的效果，我們對(duì)2019年1月至2021年12月間在我院治療不孕患者的50份精液標(biāo)本分別進(jìn)行了兩種方法的冷凍保存，并比較了復(fù)蘇后及復(fù)蘇上游處理24小時(shí)兩組的差異，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1一般資料：精液標(biāo)本均來(lái)自本院生殖中心男科實(shí)驗(yàn)室的患者，共50份，所有用于研究的精液標(biāo)本均已征得患者知情同意。精液質(zhì)量分析按照WHO《人類(lèi)精液及精子-宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》（ 第4版）進(jìn)行精液常規(guī)分析。標(biāo)本納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡25-40歲，精液量≥2ml，精子密度≥50%，存活率≥50%，禁欲時(shí)間控制在2～7天。通過(guò)手淫法收集精液于無(wú)毒、無(wú)菌取精杯中，待精液液化后，充分混勻，用定量移液器吸取10μl精液標(biāo)本置于makler精子計(jì)數(shù)板（以色列）上，使用SSA-Ⅱ型計(jì)算機(jī)自動(dòng)檢測(cè)分析系統(tǒng)（computeraided sperm analysis ，CASA，北京穗加） 依據(jù)WHO《第四版人類(lèi)精液檢查和處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》標(biāo)準(zhǔn)對(duì)精液進(jìn)行分析，檢測(cè)精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)，包括前向運(yùn)動(dòng)精子（a+b級(jí)）%，快速前向運(yùn)動(dòng)精子a%及VCL、VSL、VAP。

1.1 方法

1.2 分組：將精液標(biāo)本與精子冷凍保護(hù)劑（Nidacon，澳大利亞）按3：1比例緩慢混勻，然后根據(jù)冷凍方法的不同分為2組：A組程序降溫儀冷凍法，B組液氮熏蒸冷凍法。程序降溫儀冷凍法使用的載體為0.5ml麥管（CBS，法國(guó)），內(nèi)含冷凍精液體積為0.4ml;液氮熏蒸冷凍法根據(jù)使用不同的冷凍載體分為2組：B1組使用0.5ml麥管，B2組使用1.8ml凍存管（Thermo Scientific，美國(guó)），內(nèi)含冷凍精液體積分別為0.4ml和1.2ml。

1.3 精子冷凍及復(fù)蘇

1.3.1程序降溫儀冷凍精液：將裝有冷凍精液的0.5ml麥管放入程序化冷凍儀（Cl-8800i，澳大利亞）后，按照預(yù)設(shè)的降溫曲線(xiàn)逐步降溫，降溫結(jié)束后投入液氮。降溫曲線(xiàn)設(shè)定為：室溫23℃降至5℃，1℃ /min，5℃停留5分鐘，之后4℃降至-10.0℃，4℃ /min ，-10.0℃停留2分鐘，之后-6.0℃降至-80℃，6.0℃ /min，投入液氮。

1.3.2液氮熏蒸法冷凍精液：將裝有冷凍精液的0.5ml麥管和1.8ml凍存管按以下的步驟進(jìn)行冷凍：液氮面上方15cm 處停留15分鐘，之后在液氮面上方5cm 處停留5分鐘 ，最后浸入液氮中。

1.3.3精液復(fù)蘇及計(jì)數(shù)：

1.3.3.1 0.5ml麥管的復(fù)蘇：從液氮罐中取出冷凍載桿，擦掉外表面的霜，置于37℃恒溫水浴箱中1分鐘。擦干麥管，剪開(kāi)封口，用注射器吹出載桿中精液至離心管中，避免產(chǎn)生氣泡?；靹蚝笥枚恳埔浩魑?0μl精液標(biāo)本置于makler精子計(jì)數(shù)板上，使用CASASSA-Ⅱ型計(jì)算機(jī)自動(dòng)檢測(cè)分析系統(tǒng)依據(jù)WHO《第四版人類(lèi)精液檢查和處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》標(biāo)準(zhǔn)對(duì)精液進(jìn)行分析。每次分析至少200條以上的精子，重復(fù)2次，檢測(cè)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)：前向運(yùn)動(dòng)精子（a+b級(jí)）%，快速前向運(yùn)動(dòng)精子a%及VCL、VSL、VAP，并計(jì)算精子冷凍復(fù)蘇率= 冷凍后（a+b級(jí)）%/冷凍前（a+b級(jí)）%×100%。

1.3.3.2 1.8ml凍存管的復(fù)蘇： 將存有冷凍精子的1.8ml 凍存管從液氮中取出，擦去外表面的液氮，置于37℃水浴箱中孵育5分鐘。復(fù)蘇后的精液混勻后用定量移液器吸取10μl精液標(biāo)本，置于makler精子計(jì)數(shù)板上，使用CASA對(duì)精液進(jìn)行分析（同上）。

1.3.4 復(fù)蘇精液上游處理：為保證A組和B復(fù)蘇精液的總體積相同以減少組間差異，0.5ml冷凍麥管需復(fù)蘇3管，1.8ml冷凍管復(fù)蘇1管，使兩組復(fù)蘇的精液總體積一致。采用上游法處理精液：將培養(yǎng)液與復(fù)蘇精液按照體積1：1混勻，500g 離心5分鐘。棄上清，沿管壁緩慢加入0.3ml G-mops plus，蓋緊管口，置于 37℃培養(yǎng)箱上游60分鐘。上游結(jié)束后用巴斯吸管小心吸取上層液體。調(diào)整精子終濃度為10～15*106/ml，取10μl精液標(biāo)本置于makler精子計(jì)數(shù)板上，使用CASA對(duì)精液進(jìn)行分析。剩余精子蓋緊后室溫中放置24小時(shí)。24小時(shí)后，混勻精子標(biāo)本，取10μl標(biāo)本置于makler精子計(jì)數(shù)板上，使用CASA檢測(cè)以下精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)：（a+b級(jí)）%、a級(jí)精子%、以及VCL、VSL、VAP。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析：本文所有數(shù)據(jù)用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，計(jì)量資料以（x±s） 表示，組間均數(shù)比較用Friedman秩和檢驗(yàn)，兩兩比較用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2、結(jié)果

2.1 兩組復(fù)蘇后精子參數(shù)對(duì)比

程序降溫儀冷凍法（A組）和液氮熏蒸法（B組）兩組精液復(fù)蘇后的參數(shù)如表一，兩種冷凍方法以及使用不同冷凍載體冷凍精子的復(fù)蘇率、復(fù)蘇后（a+b級(jí)）精子百分率、a級(jí)精子百分率、VCL、VSL、VAP參數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.2 經(jīng)上游處理24小時(shí)后精子參數(shù)對(duì)比

兩種冷凍方法以及使用不同冷凍載體冷凍精子復(fù)蘇后經(jīng)上游法處理，24小時(shí)后（a+b級(jí)）精子百分率、a級(jí)精子百分率、VCL、VSL、VAP參數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

3 討論

人類(lèi)精子在冷凍過(guò)程中不可避免地會(huì)受到一些物理和化學(xué)效應(yīng)的影響，原因就在于降溫過(guò)程中產(chǎn)生的冰晶帶來(lái)的機(jī)械損傷及高滲透性帶來(lái)的化學(xué)損傷。不過(guò)，人類(lèi)精子能夠耐受一定范圍內(nèi)的冷凍傷害，這可能與精子膜上磷脂、糖脂及固醇含量有關(guān)，而且因?yàn)榫觾?nèi)水分含量較少（ 約為50%） ，精子比其它細(xì)胞更能耐受低溫導(dǎo)致的損傷【3】。

精子冷凍較常使用的是程序降溫儀冷凍法和液氮蒸汽熏蒸法。使用程序降溫法冷凍精子需要事先對(duì)程序降溫儀設(shè)定降溫曲線(xiàn)。最開(kāi)始的時(shí)候降溫平緩，使精子逐步適應(yīng)低溫環(huán)境，可減少冷休克的發(fā)生，然后相對(duì)快速的降溫，使得細(xì)胞外液滲透壓升高，水分從滲透壓低的內(nèi)液通過(guò)細(xì)胞膜流向滲透壓高的外液，于是精子細(xì)胞自身皺縮，逐漸完成脫水的過(guò)程，從而減少精子內(nèi)冰晶的發(fā)生。使用程序降溫儀冷凍精子控溫精確，是WHO推薦的精子冷凍方法[4]，缺點(diǎn)是需要專(zhuān)用程序化降溫儀設(shè)備，耗時(shí)較長(zhǎng)，部分冷凍儀還受到冷凍載體的限制，無(wú)法大規(guī)模冷凍精液。而液氮熏蒸法比較簡(jiǎn)單快捷，一次可以冷凍多管精液，如果測(cè)量液面高度統(tǒng)一，在幾個(gè)溫控的關(guān)鍵點(diǎn)降溫都比較合理，人為操作培訓(xùn)得力，也是可以獲得穩(wěn)定、重復(fù)性好的結(jié)果。

無(wú)論使用哪種方法，復(fù)蘇后的精子都有一定的死亡比例。劉勇等認(rèn)為熏蒸法解凍后精子活力及復(fù)蘇率得到顯著提高[5]，而李玉山等認(rèn)為兩者復(fù)蘇效果沒(méi)有顯著差異，均可在人類(lèi)精子冷凍獲得良好效果[6-7]。本研究的結(jié)果表明兩種冷凍方法解凍后的精子存活率及運(yùn)動(dòng)能力都沒(méi)有顯著差異，都獲得了較好的復(fù)蘇效果。不過(guò)，熏蒸法在緩慢降溫和快速降溫兩個(gè)階段的溫控仍然不及程序冷凍儀降溫過(guò)程中的精細(xì)，因此液氮熏蒸法仍需進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。

精子的前向運(yùn)動(dòng)率以及VCL、VSL、VAP等運(yùn)動(dòng)參數(shù)作為反應(yīng)精子活力的有效指標(biāo)，對(duì)男性不育的診斷和生育能力的評(píng)估具有一定的臨床意義[8]。精子是否較長(zhǎng)時(shí)間維持快速有力的運(yùn)動(dòng)能力對(duì)后續(xù)的受精有著重要的意義，因此，本文比較24小時(shí)后程序降溫組和液氮熏蒸組復(fù)蘇精子活力的差異意在進(jìn)一步評(píng)估冷凍對(duì)兩組精子活力的差異，結(jié)果顯示液氮熏蒸法在復(fù)蘇精子上游處理24小時(shí)后仍維持了較好的運(yùn)動(dòng)能力，同程序冷凍法比較差異是不顯著的，進(jìn)一步說(shuō)明熏蒸法冷凍復(fù)蘇后的精子也可以獲得較好的效果。當(dāng)然，在人類(lèi)精子冷凍原理和冷凍損傷領(lǐng)域，還需要更深入的研究以期得到更好、更穩(wěn)定的精子冷凍方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]Watson PF. Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-thawingfunction.Reprod，. Fertil Dev，1995，7（4）： 871-891.

[2]范立青、朱文兵、肖紅梅等。解凍后活動(dòng)精子總數(shù)對(duì)他精人工授精妊娠率的影響研究[J]?！吨袊?guó)醫(yī)師雜志》2001年3卷9期 572-573，578頁(yè)

[3]熊承良，商學(xué)軍，劉繼紅主編. 人類(lèi)精子學(xué). 北京： 人民衛(wèi)生出版社，2013. 613-624.

[4]World Health Organization.WHO laboratory manual for theexamination and processing of human semen.5th ed.Geneva：WHO，2010.

[5] 劉勇，肖玉芳，趙東，施文博，盧慧，王如瑤，胡洪亮，李錚。人類(lèi)精液一步熏蒸法凍融的實(shí)驗(yàn)研究。中華男科學(xué)雜志 2012 年3 月 第18 卷 第3 期

[6] 李玉山，王全先，高學(xué)敏，等. 程序冷凍法、液氮熏蒸法冷凍人類(lèi)精子的效果比較. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18 （ 9） ：1814-1815.

[7] 劉睿智，孫妍，許宗革，等. 速凍和緩慢冷凍法對(duì)精子運(yùn)動(dòng)特征的影響. 中國(guó)男科學(xué)雜志，2006，20（ 1） ： 8-10.

[8] 屈宗銀. 精子活力與精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)關(guān)系的研究. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，6（23）： 1995-1996.

作者簡(jiǎn)介：何紅梅（1978-），女，云南曲靖人，副主任醫(yī)師，從事輔助生殖臨床和科研工作

通訊作者：王艷玲，E-mail： wangnancy2013@163.com

基金項(xiàng)目：云南省生殖婦產(chǎn)疾病臨床醫(yī)學(xué)中心（zx2019-01-01）;云南省生殖婦產(chǎn)疾病臨床醫(yī)學(xué)中心開(kāi)放課題（2019LCZXKF-SZ06）