張賀翠 馮萍 李幫秀 薛雨飛 楊昆 朱利泉

摘 要 針對農(nóng)林專業(yè)教學(xué)的特點(diǎn)，設(shè)計了“實(shí)時熒光定量PCR分析不同氮肥施用量下煙葉團(tuán)棵期葉片中NtCIPK8的定量表達(dá)”實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生了解不同施氮量下，相同組織中同一個基因的表達(dá)量不同的知識，還將基因表達(dá)的特點(diǎn)從一個抽象的概念轉(zhuǎn)化為了具體的數(shù)字圖形，同時使學(xué)生可以掌握實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的原理、方法和儀器的使用，為增強(qiáng)農(nóng)林專業(yè)學(xué)生的科研能力和綜合素質(zhì)提供了新的內(nèi)容。

關(guān)鍵詞 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);實(shí)時熒光定量PCR;NtCIPK8;本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)

中圖分類號：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.07.062

分子生物學(xué)是生物學(xué)的前沿與生長點(diǎn)，是指從分子水平研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能從而闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)的科學(xué)，它同時是一門理論與實(shí)踐相結(jié)合的綜合性的新興學(xué)科[1]。分子生物學(xué)主要的研究領(lǐng)域是蛋白質(zhì)體系、蛋白質(zhì)-核酸體系（中心是分子遺傳學(xué)）和蛋白質(zhì)-脂質(zhì)體系（即生物膜），它目前是農(nóng)林院校生物專業(yè)和涉農(nóng)專業(yè)的重要課程，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域普遍運(yùn)用的方法和手段，實(shí)驗(yàn)課是一門讓學(xué)生理解、掌握分子生物學(xué)技術(shù)的課程[2]。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種根據(jù)生物體內(nèi)DNA半保留式復(fù)制的特點(diǎn)而設(shè)計的在體外對特定的DNA序列放大擴(kuò)增的新技術(shù)。PCR反應(yīng)最大的特點(diǎn)是將微量的DNA進(jìn)行快速大幅度的擴(kuò)增，例如化石中的古生物，或者脫落許久的毛發(fā)甚至皮膚中只要有一點(diǎn)點(diǎn)DNA都可以通過PCR技術(shù)加以擴(kuò)增和放大，因此目前在分子生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科中得到廣泛的應(yīng)用[3]。

實(shí)時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)是在普通的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核算檢測技術(shù)[4]。qRT-PCR的基本原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法[5]。由于qRT-PCR技術(shù)較常規(guī)PCR技術(shù)相比，具有污染少、定量準(zhǔn)確、實(shí)時監(jiān)測、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，qRT-PCR技術(shù)在目前的科學(xué)研究中大量使用，經(jīng)常在轉(zhuǎn)基因檢測、作物育種、環(huán)境科學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中使用[6]。例如新冠肺炎病毒的核酸檢測，通過qRT-PCR技術(shù)檢測熒光信號累積確定是否有新型冠狀病毒，如果是帶有病毒的患者會檢測出熒光信號增強(qiáng)，這樣就可以顯示陽性的結(jié)果。如果是核酸檢測沒有病毒的患者樣本，因?yàn)闆]有靶基因的擴(kuò)增，就檢測不到熒光信號增強(qiáng)，這樣的結(jié)果就屬于新冠肺炎核酸檢測陰性[7]。NCBI中可以搜索到的使用qRT-PCR做基因表達(dá)分析的文章至少20萬篇，中國知網(wǎng)上收集的基因表達(dá)的文章至少2萬篇。例如西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院年均發(fā)表80余篇與此相關(guān)的文章，其中水稻、油菜等科研團(tuán)隊(duì)在應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)方面取得了一系列重大成果，其相關(guān)研究成果在Plant Cell、PNAS、Nucleic Acids Research等國際學(xué)術(shù)刊物發(fā)表。

但是由于購買熒光定量PCR儀成本高，維護(hù)費(fèi)用高，每個學(xué)生的使用成本在30元左右，限制了其在本科生教學(xué)中的使用，但是近年來，如何在本科生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中讓學(xué)生掌握以后的科研工作中常用的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，培養(yǎng)本科生的綜合能力和科研素養(yǎng)，促進(jìn)教學(xué)與科研的相互融合已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的重要方向[8]。因此，我們在本科生的教學(xué)工作中初步進(jìn)行了不同氮肥施用量下團(tuán)棵期煙葉葉片中NtCIPK8的定量表達(dá)，并取得了較好的數(shù)據(jù)，讓本科生了解到環(huán)境因素也會影響基因的表達(dá)，由于進(jìn)行的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)涉及到引物的設(shè)計、內(nèi)參基因的選擇、RNA樣本制備及純化、反轉(zhuǎn)錄cDNA、相對定量法中內(nèi)參基因的校準(zhǔn)和樣品基因的定量檢測，掌握到這些基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?教學(xué)安排

1）實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果分析共計6個學(xué)時;2）實(shí)驗(yàn)分組：每2個學(xué)生一組;3）學(xué)生提前預(yù)習(xí)熒光定量PCR的原理、實(shí)驗(yàn)方法、操作步驟及注意事項(xiàng);4）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，課堂上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析和討論，學(xué)生提交實(shí)驗(yàn)報告。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)材料

材料：培養(yǎng)箱培養(yǎng)煙草植株到五葉一心期進(jìn)行移栽，設(shè)置純氮使用量75.0 kg·hm-2（T1）、90.0 kg·hm-2（T2）、105.0 kg·hm-2（CK）112.5 kg·hm-2（T3）、120.0 kg·hm-2（T4）、135.0 kg·hm-2（T5）、150.0 kg·hm-2（T6）、165.0 kg·hm-2的8個處理，其他施肥參照常規(guī)施肥方案進(jìn)行施肥，移栽后植株長到團(tuán)棵期取葉片，液氮中凍存后放到-80 ℃冰箱保存。

1.3 ?實(shí)驗(yàn)儀器

熒光定量PCR儀定為BIO-Rad CFX Connect Real-Time PCR System，凝膠電泳裝置，微量核酸測定儀。

1.4 ?實(shí)驗(yàn)方法

使用RNA植物提取試劑盒（天根）從8個處理的葉片中提取RNA，并純化，利用高質(zhì)量的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將純化后的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以β-Actin為內(nèi)參基因擴(kuò)增NtCIPK8基因的表達(dá)量（見表1）。樣本每個處理重復(fù)3次，反應(yīng)體系為20 μL：2 μL cDNA，上、下游引物各0.6 μL，SYBR10.4 μL，ddH2O補(bǔ)齊20 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，57 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線及熔解曲線?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量采用2-ΔΔCT計算[9]。

表1 ?NtCIPK8和β-Actin的引物序列

[引物名稱 序列（5'→3'） NtCIPK8-F ATTGAACTGTTTAGGAGGCAGA NtCIPK8-R TCATCCCTTCCGATTTAGCTAC β-Actin-F AACAGTTTGGTTGGAGTTCTGG β-Actin-R CATGAAGATTAAAGGCGGAGTG ]

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同氮肥施用量的煙葉團(tuán)棵期葉片總RNA的提取

以8個處理的煙葉葉片為材料，參照植物總RNA提取試劑盒說明書提取煙葉葉片重的總RNA，通過超微量分光光度計檢測其OD值和濃度，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中所提取的葉片中RNA純度（OD260/280）值均在1.8～2.1，表明RNA純度較高，可以用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

將提取的RNA經(jīng)1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳分離，如圖1所示，各RNA條帶明亮而沒有降解，28S和18S條帶在亮度上接近2∶1，5S條帶較暗，表明RNA的純度和完整性較好，能夠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

2.2 ?PCR產(chǎn)物的溶解曲線

從圖2、圖3可知，內(nèi)參基因β-Actin和8個處理的煙葉葉片的NtCIPK8基因的溶解曲線均為單一峰，沒有其他峰的出現(xiàn)，同時圖3中的峰的形狀比較銳利，表明NtCIPK8基因在不同處理下的溶解溫度均一性比較好，同時表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性好，沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

2.3 ?NtCIPK8基因擴(kuò)增曲線

圖4的擴(kuò)增曲線分成了3個階段，分別是熒光背景階段、熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段及熒光信號擴(kuò)增平穩(wěn)期?；驍U(kuò)增曲線整體光滑且平穩(wěn)性較好，形狀“S”完整性好，符合熒光定量檢測的要求。

2.4 ?不同處理下煙葉團(tuán)棵期葉片中NtCIPK8表達(dá)量

圖5結(jié)果表明：通過熒光定量PCR數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在不同處理下團(tuán)棵期的葉片中NtCIPK8均有表達(dá)，呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢，不同處理后煙葉葉片團(tuán)棵期NtCIPK8的表達(dá)存在差異。其中在處理T3（純氮7.5 kg/667 m2）的葉片中NtCIPK8的表達(dá)量最高，處理T1（純氮5.0 kg/667 m2）的葉片中NtCIPK8的表達(dá)量最低。

3 ?結(jié)論與討論

學(xué)生們通過獨(dú)自提取RNA并純化、反轉(zhuǎn)錄、使用熒光PCR儀擴(kuò)增了8個處理下煙葉中NtCIPK8的表達(dá)量，CIPKs一類蛋白激酶家族，它是Ca2+感受器CBLs（Calcineurin B-like proteins，CBLs）的靶蛋白，CIPK與CBL形成復(fù)合體[10];Ca2+與CBL結(jié)合后，CBLs的構(gòu)型發(fā)生變化，它的疏水性結(jié)合位點(diǎn)暴露到外面，疏水性結(jié)合位點(diǎn)與CIPKs的NAF結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促使CIPKs釋放自抑制區(qū)，CBL/CIPK復(fù)合體被激活，從而調(diào)控細(xì)胞的代謝[11]。CIPK8是CIPKs的家族成員，它可能參與了植物的脅迫信號途徑[12]，同學(xué)們通過獨(dú)自提取RNA并純化、反轉(zhuǎn)錄、使用熒光PCR儀擴(kuò)增了8個處理下煙葉中NtCIPK8的表達(dá)量，通過熒光定量PCR擴(kuò)增了8個處理下煙葉中NtCIPK8的表達(dá)量不僅使學(xué)生們掌握了實(shí)驗(yàn)技術(shù)，還了解了不同施氮量下相同組織中同一個基因的表達(dá)量也會不同，將基因表達(dá)的特點(diǎn)從一個抽象的概念轉(zhuǎn)化為了具體的數(shù)字圖形。

由于涉及到引物的設(shè)計、內(nèi)參基因的選擇、RNA樣本制備及純化、反轉(zhuǎn)錄cDNA、相對定量法中內(nèi)參基因的校準(zhǔn)和樣品基因的定量檢測，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，容易由于所使用的試劑及操作者的技術(shù)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差較大，甚至?xí)霈F(xiàn)失敗的現(xiàn)象[13]。其中qRT-PCR的引物設(shè)計和內(nèi)參基因的選擇至關(guān)重要，引物設(shè)計過程中設(shè)計到引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、非特異性擴(kuò)增、退火溫度的選擇等，均會影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[5];篩選到合適的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，可以給靶基因提供參考數(shù)據(jù)，同時可以消除因模板濃度不同帶來的實(shí)驗(yàn)誤差。提取樣品RNA的時候要特別注意RNA的降解和污染，要使用無RNA酶的器皿等。

本次實(shí)驗(yàn)是一次探索性的教學(xué)實(shí)驗(yàn)，由本科生為主體，老師作指導(dǎo)，綜合一系列實(shí)驗(yàn)而最終獲得結(jié)果，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果與研究生做的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相一致，表明本科生通過提前預(yù)習(xí)、課堂講解、實(shí)際操作是可以達(dá)到較高的水平的，這里也顯示出實(shí)驗(yàn)整體設(shè)計的重要性，整個研究項(xiàng)目進(jìn)行合理的規(guī)劃設(shè)計就可以使得學(xué)生們?nèi)菀撞僮?，?shí)驗(yàn)誤差減少。

該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目具有較強(qiáng)的連貫性和綜合性，雖然實(shí)驗(yàn)成本較高，對學(xué)生的理論知識和操作技能也都有較為嚴(yán)格的要求，但是我們應(yīng)該以“雙一流”學(xué)科建設(shè)和“新農(nóng)科”人才培養(yǎng)為契機(jī)，以教育部《實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)》《專業(yè)實(shí)驗(yàn)室評估標(biāo)準(zhǔn)》為標(biāo)準(zhǔn)，秉承傳授知識、培養(yǎng)能力、提高素質(zhì)的指導(dǎo)思想，緊緊圍繞提高本科教學(xué)質(zhì)量，建設(shè)高水平的農(nóng)學(xué)類、生物類實(shí)驗(yàn)教學(xué)共享平臺;深化實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革和管理體制改革，構(gòu)建與專業(yè)人才培養(yǎng)目標(biāo)相適應(yīng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系，建立功能完善、結(jié)構(gòu)合理、管理高效的實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行機(jī)制和管理體系;優(yōu)化實(shí)驗(yàn)隊(duì)伍結(jié)構(gòu)，提高實(shí)驗(yàn)教師專業(yè)技術(shù)水平，建立專兼職有機(jī)結(jié)合的高素質(zhì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)隊(duì)伍;遵循“高起點(diǎn)、新思路、有特色、重效用”的原則，突出重點(diǎn)、分期建設(shè)，加強(qiáng)中心信息化、設(shè)備更新、創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室和實(shí)習(xí)基地等建設(shè)，夯實(shí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)在創(chuàng)新人才培養(yǎng)等方面的重要作用。

4 ?結(jié)語

利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測基因表達(dá)量可以讓學(xué)生快速地掌握基因表達(dá)檢測技術(shù)，數(shù)字、柱形圖等可以讓學(xué)生直觀地了解基因在器官和組織的表達(dá)狀況。提高本科生培養(yǎng)質(zhì)量，充分發(fā)揮實(shí)驗(yàn)室在實(shí)踐和創(chuàng)新能力培養(yǎng)中的特殊作用，凸顯本科教育的特色，提高學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)技能，以實(shí)驗(yàn)教學(xué)來進(jìn)一步促進(jìn)理論教學(xué)，同時能提高各專業(yè)學(xué)生解決具體問題的能力，為培養(yǎng)本科生創(chuàng)新意識和開展更深層次的研究工作打下良好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] ? 尹海波，張俠.高等學(xué)校分子生物學(xué)教學(xué)改革初探[J].科教文匯，2021，30：73-75.

[2] ? 曾穎玥，牟藤，朱春玉，等.基于“互聯(lián)網(wǎng)+”的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系改革[J].軟件導(dǎo)刊，2021，20（5）：183-187.

[3] ? 秦余香.高級分子生物學(xué)技術(shù)教學(xué)改革研究[J].教育教學(xué)論壇，2020（52）：144-145.

[4] ? 曹榮月，陳軒，卞筱泓，等.結(jié)合PCR技術(shù)淺談實(shí)驗(yàn)儀器PCR儀在本科教學(xué)中的應(yīng)用[J].教育現(xiàn)代化雜志，2018，28（52）：134-135.

[5] ? 薛雨飛，柴友榮，張賀翠，等.淺談如何做好分子生物學(xué)課程實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作[J].才智，2019（32）：10.

[6] ? 羅曉婷，許春鵑，洪蘆燕，等.生物化學(xué)與分子生物學(xué)“四融入四結(jié)合”課程思政教學(xué)體系的構(gòu)建與應(yīng)用[J].生命的化學(xué)，2021，41（10）：2307-2314.

[7] ? 林琦，黃枝妙.福建省1例輸入性新型冠狀病毒全基因組測序分析[J].口岸衛(wèi)生控制，2021，26（5）：51-55.

[8] ? 王曉，全裔，蔣冬香.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科生在檢驗(yàn)科PCR室實(shí)習(xí)帶教模式的探索與實(shí)踐[J].華夏醫(yī)學(xué)，2018，31（4）：148-150.

[9] ? Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2- ΔΔCT method[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[10] Chaves A S， Barrena M J， Rubio J M， et al. Structural basis of the regulatory mechanism of the plantCIPK family of protein kinases controlling ion homeostasis and abiotic stress[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2014，111（42）：E4532-41.

[11] Barrena M S， Ripoll M M， Albert A. Structural Biology of a Major Signaling Network that Regulates Plant Abiotic Stress： The CBL-CIPK Mediated Pathway[J].International Journal of Molecular Sciences，2013，14（3）：103-144.

[12] Edel K H， Kudla J. Integration of calcium and ABAsignaling[J].Current Opinion in Plant Biology， 2016，33：83-91.

[13] 李欣，趙玉紅，趙立青，等.實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2018（4）：67-70，74.

（責(zé)任編輯：敬廷桃）

收稿日期：2021-12-27

基金項(xiàng)目：西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究項(xiàng)目（SYJ2021023）;西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心建設(shè)項(xiàng)目。

作者簡介：張賀翠（1985—），女，河南滑縣人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事植物生理生化研究。E-mail：zhanghecui226@163.com。

*為通信作者，E-mail：zhuliquan@swu.edu.cn。