楊柳，劉強勝，張彬，何倩雯，李禎，劉安鵬，鄭鋒，詹佳*

1武漢大學中南醫(yī)院麻醉科，武漢 430071；2湖北文理學院附屬醫(yī)院/襄陽市中心醫(yī)院麻醉科，湖北襄陽 441000

膿毒癥是由于入侵的病原體引起的免疫應答不能恢復到穩(wěn)態(tài)，最終形成以持續(xù)的過度炎癥及免疫抑制為特征的病理綜合征[1]。近年來，雖然人們對膿毒癥復雜病理機制的認識有所提升，并實施了早期目標導向治療、使用抗生素及生命體征支持等治療方案，但并未降低其高重癥率及高病死率的現(xiàn)狀[2]。隨著對膿毒癥誘導的免疫抑制在器官功能損傷方面研究的深入，靶向細胞焦亡通路的臨床試驗將為膿毒癥患者的治療提供更多的選擇[3-4]。焦亡是由半胱天冬酶(caspase)-1介導的一類伴有炎性介質(zhì)釋放的程序性細胞死亡[5]。肺臟是膿毒癥發(fā)生時極易損傷的器官之一[6]，膿毒癥早期即可發(fā)生急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征，與膿毒癥的發(fā)病率及病死率密切相關[7]。在膿毒癥發(fā)生過程中，激活的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)一方面通過上調(diào)含pyrin結構域核苷酸結合寡聚結構域樣受體家族3(nucleotide-binding oligomerization domain,leucine- rich repeat and pyrin domain-containing 3，NLRP3)炎性小體促進細胞焦亡，另一方面通過激活MyD88及核因子(NF)-κB信號通路，上調(diào)IL-1RI的表達，增加細胞對IL-Iβ的敏感性，從而促進細胞焦亡，兩者相互作用加重肺損傷[8]。所以，抑制肺組織細胞焦亡在膿毒癥急性肺損傷的治療中尤為重要。組織蛋白酶B(cathepsin B，CTSB)是一種在多種細胞中廣泛表達的半胱氨酸蛋白水解酶[9]，其表達異常增加或過度激活與炎癥、感染、腫瘤及神經(jīng)退行性疾病密切相關[10]。CTSB抑制劑的臨床應用受到廣泛關注，但其是否能通過抑制細胞焦亡從而改善膿毒癥，目前尚未明確。本研究通過建立膿毒癥小鼠急性肺損傷模型，探討能否通過靶向抑制CTSB的表達抑制肺組織焦亡，從而改善膿毒癥引起的急性肺損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及處理 30只SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，8～10周齡，體重(23±1) g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養(yǎng)于武漢大學中南醫(yī)院動物實驗中心。采用隨機數(shù)字表法分為3組：假手術組(n=6)、膿毒癥組(n=15)及膿毒癥+組織蛋白酶B抑制劑CA-074組(膿毒癥+CA-074組，n=9)。膿毒癥組及膿毒癥+CA-074組均使用經(jīng)典的盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)法[11]構建小鼠膿毒癥模型：將小鼠用戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于手術臺上，剔除手術部位體毛，消毒手術野，于劍突下1 cm沿腹中線作一條長1～2 cm的切口，打開腹腔，探取盲腸并分離，注意避免損傷血管及腹腔臟器。用4-0絲線小心結扎盲腸遠端1/3處，于盲腸盲端至結扎部位的中點處，用20G無菌針頭刺穿盲腸，擠出少許腸內(nèi)容物后將盲腸放回腹腔，并逐層關腹。術畢皮下注射預熱的37 ℃無菌生理鹽水(5 ml/100 g)復蘇，并在暖燈下觀察至少2 h。假手術組除不行盲腸結扎及穿孔外，其他操作同膿毒癥組。術后15 min，膿毒癥+CA-074組小鼠腹腔注射10 mg/kg CA-074。實驗過程符合國家及單位有關動物管理和使用的規(guī)定。

1.2 小鼠肺泡灌洗液中白細胞計數(shù)及白細胞介素(IL)-18、IL-1β水平檢測 CLP術后24 h，將小鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后固定于試驗臺上，頸部消毒，暴露右主支氣管，注意避免傷及血管，用20G靜脈留置針穿刺氣管并結扎固定。1 ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩慢注入肺部，輕輕擠壓胸廓約3 s后回抽，將回抽液置于5 ml的Eppendorf 3810型微量離心管中，重復上述操作3次。將回收液于4 ℃下1500×g離心10 min，收集上清，-20 ℃保存，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測細胞因子IL-18、IL-1β水平。采用改良牛鮑計數(shù)板計數(shù)下層液中白細胞的數(shù)量。

1.3 小鼠肺組織病理學變化及肺損傷評分 取右側中葉肺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，將切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘，酸水及氨水中分色，流水沖洗脫水后，酒精伊紅染色液染色2～3 min。染色完成后，脫水封片，光學顯微鏡觀察。根據(jù)肺組織病理學變化(組織壞死、肺泡水腫、透明膜形成、出血及炎性細胞浸潤等)進行肺損傷評分，視病變程度依次計為0～4分。無病變計0分，病變范圍≤10%計0.5分，病變范圍10%～25%計1分，病變范圍25%～50%計2分，病變范圍50%～75%計3分，病變范圍＞75%計4分，總分0～16分。

1.4 肺組織濕/干重比 取左側肺組織，用吸水紙吸取表面水分及血液，稱重為濕重(W)。置于65 ℃恒溫烘箱中，每24 h稱重1次，直至前后兩次重量之差小于1%，記錄為干重(D)。計算濕/干重比(W/D)。

1.5 RT-PCR法測定肺組織相關基因mR NA表達水平 取右上葉肺組織，采用Tr i z o l(國藥集團化學試劑有限公司)法提取總R N A。按照EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(武漢ELK Biotechnology公司)使用說明進行反轉錄。以β-actin為內(nèi)參照。引物序列如下：β-actin上游5'-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3'，下游5'-CCACAGGATTCCATACCCAAGA-3'；小凹蛋白-1(caveolin-1)上游5'-AGGTGACTGAGAAGCAAGT GTATG-3'，下游5'-CAAGCGGTAAAACCAATATTT TG-3'；單核細胞趨化蛋白誘導蛋白1(MCPIP1)上游5'-CCCAAGCCTTCCACTCTAGAAC-3'，下游5'-TTCCTCCAAGATGGCACAAAC-3'；Caspase-1上游5'-GATGGCATTAAGAAGGCCCA-3'，下游5'-CCC TATCAGCAGTGGGCATC-3'；成孔效應蛋白D(gasdermin D，GSDMD)上游5'-CGTGGCAGGAGCA GAGTTCT-3'，下游5'-ATAGAGCGCACTTGTGGGG A-3'；CTSB上游5'-GCTGTCGGATGACCTGATTAA C-3'，下游5'-ATCTATGTCCTCACCGAACGC-3'。按照EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix試劑盒(武漢ELK Biotechnology公司)說明書操作，采用10 μl體系進行PCR擴增。反應體系：2×Master Mix 5.0 μl，引物工作液(2.5 μmol/L)1.0 μl，模板1.0 μl，ddH2O 2.0 μl，PCR儀校正染料1.0 μl。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40次。使用StepOneTMReal-Time PCR儀(美國Life Technologies公司)進行擴增并分析處理數(shù)據(jù)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.6 Western blotting測定肺組織中CTSB、caspase-1及G S D M D 蛋白表達水平 取右下葉肺組織50～100 mg，置于1～2 ml勻漿器中，用干凈的剪刀將組織塊剪碎，按照每20 mg組織150～250 μl裂解液的比例加入高效RIPA組織/細胞裂解液(美國ASPEN公司)，冰上勻漿，于4 ℃下13 000×g離心15 min，收集上清并使用BCA法檢測蛋白濃度。取40 μg總蛋白上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，分離蛋白轉印至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，以阻斷非特異性結合，再加入兔抗鼠β-actin一抗(1:10 000)、兔抗鼠CTSB一抗(1:1000)、兔抗鼠caspase-1一抗(1:1000)、兔抗鼠GSDMD一抗(1:1000)，以上抗體均購自武漢三鷹生物科技有限公司，4 ℃脫色搖床孵育過夜。用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min。使用上述方法稀釋HRP山羊抗兔二抗(1:10 000，美國ASPEN公司)，室溫下孵育1～2 h，洗膜后ECL法顯影。

1.7 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0及GraphPad Prism 8進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗及Tamhane's T2檢驗。計數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 CLP術后24 h小鼠基本情況及存活率 與術前相比，假手術組小鼠術后24 h基本情況無明顯變化，存活率100.0%；膿毒癥組小鼠出現(xiàn)背部豎毛、行動遲緩、厭食、精神萎靡、寒顫抽搐等癥狀，存活率為40.0%(6/15)；膿毒癥+CA-074組小鼠的上述癥狀有不同程度的緩解，存活率為66.7%(6/9)。與假手術組比較，膿毒癥組小鼠24 h存活率明顯降低(P＜0.05)；膿毒癥+CA-074組與膿毒癥組小鼠存活率無明顯差異(P＞0.05)。

2.2 各組小鼠肺組織病理變化 假手術組肺泡結構清晰，肺泡壁不厚，肺間質(zhì)內(nèi)幾乎無炎性細胞浸潤；與假手術組比較，膿毒癥組肺泡結構破壞嚴重，肺泡間隔增厚及水腫，肺間質(zhì)中見大量炎性細胞浸潤及點狀或片狀出血灶；與膿毒癥組比較，膿毒癥+CA-074組肺泡結構破壞減輕，肺間質(zhì)水腫緩解，間質(zhì)內(nèi)炎性細胞浸潤減少(圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織病理學變化(HE染色，×400)Fig.1 Pathological changes of lung tissues of mice in each group (HE ×400)

2.3 各組小鼠肺組織相關指標比較 與假手術組比較，膿毒癥組損傷性指標caveolin-1mRNA水平明顯升高，修復性指標MCPIP1mRNA水平明顯降低，肺損傷評分增加，肺組織濕/干重比增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與膿毒癥組相比較，膿毒癥+CA-074組caveolin-1mRNA水平降低，MCPIP1mRNA水平升高，肺損傷評分降低，肺組織濕/干重比降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表1)。

表1 各組小鼠肺組織中caveolin-1及MCPIP1 mRNA水平、肺損傷評分及肺組織濕/干重比值比較 (±s，n=6)Tab.1 Comparison of caveolin-1 and MCPIP1 mRNA level, lung injury score and wet/dry weight ratio of lung tissues of mice in each group (±s, n=6)

表1 各組小鼠肺組織中caveolin-1及MCPIP1 mRNA水平、肺損傷評分及肺組織濕/干重比值比較 (±s，n=6)Tab.1 Comparison of caveolin-1 and MCPIP1 mRNA level, lung injury score and wet/dry weight ratio of lung tissues of mice in each group (±s, n=6)

Caveolin-1. 小凹蛋白-1；MCPIP1. 單核細胞趨化蛋白誘導蛋白1；與假手術組比較，(1)P＜0.05；與膿毒癥組比較，(2)P＜0.05

組別 Caveolin-1 mRNA MCPIP1 mRNA 肺損傷評分(分) 肺組織濕/干重比假手術組 1.00±0.09 0.98±0.13 0.93±0.27 5.37±0.52膿毒癥組 3.01±0.34(1) 0.24±0.02(1) 11.35±1.73(1) 14.32±2.16(1)膿毒癥+CA-074組 1.77±0.15(1)(2) 0.55±0.07(1)(2) 8.45±2.36(1)(2) 11.12±2.01(1)(2)F 126.889 103.084 60.091 41.235 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 各組小鼠炎性指標比較 與假手術組比較，膿毒癥組肺泡灌洗液中白細胞計數(shù)增加，焦亡相關炎性因子IL-18、IL-1β水平上升，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與膿毒癥組比較，膿毒癥+CA-074組白細胞計數(shù)減少，IL-18、IL-1β水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表2)。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中白細胞計數(shù)及IL-18、IL-1β水平比較 (±s，n=6)Tab.2 Comparison of leukocytes count, IL-18 and IL-1β levels in BALF of mice in each group (±s, n=6)

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中白細胞計數(shù)及IL-18、IL-1β水平比較 (±s，n=6)Tab.2 Comparison of leukocytes count, IL-18 and IL-1β levels in BALF of mice in each group (±s, n=6)

IL-18. 白細胞介素-18；IL-1β. 白細胞介素-1β；BALF. 支氣管肺泡灌洗液；與假手術組比較，(1)P＜0.05；與膿毒癥組比較，(2)P＜0.05

組別 白細胞計數(shù)(×108/L) IL-18(pg/ml) IL-1β(pg/ml)假手術組 1.37±0.15 33.51±2.71 69.88±5.63膿毒癥組 6.20±1.10(1) 217.79±15.61(1) 311.34±17.43(1)膿毒癥+CA-074組 4.60±0.50(1)(2) 197.68±11.95(1)(2) 227.00±11.38(1)(2)F 73.771 466.879 581.040 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 各組小鼠肺組織CTSB、caspase-1及GSDMDmRNA表達水平比較 與假手術組比較，膿毒癥組中CTSB、caspase-1及GSDMDmRNA表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與膿毒癥組比較，膿毒癥+CA-074組中CTSBmRNA表達無明顯變化(P=0.973)，caspase-1及GSDMDmRNA表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表3)。

表3 各組小鼠肺組織中CTSB、caspase-1及GSDMD mRNA表達水平比較(±s，n=6)Tab.3 Comparison of the expression levels of CTSB, caspase-1 and GSDMD mRNA in lung tissues of mice in each group (±s,n=6)

表3 各組小鼠肺組織中CTSB、caspase-1及GSDMD mRNA表達水平比較(±s，n=6)Tab.3 Comparison of the expression levels of CTSB, caspase-1 and GSDMD mRNA in lung tissues of mice in each group (±s,n=6)

組別 CTSB mRNA Caspase-1 mRNA GSDMD mRNA假手術組 0.99±0.08 1.00±0.06 1.00±0.18膿毒癥組 5.31±0.26(1) 6.33±0.29(1) 11.17±0.41(1)膿毒癥+CA-074組 5.32±0.32(1) 4.83±0.23(1)(2) 9.87±0.39(1)(2)F 618.739 940.458 1536.724 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.6 各組小鼠肺組織CTSB、caspase-1及GSDMD蛋白表達水平比較 與假手術組比較，膿毒癥組CTSB、caspase-1及GSDMD蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與膿毒癥組比較，膿毒癥+CA-074組中CTSB、caspase-1及GSDMD蛋白表

CTSB. 組織蛋白酶B；Caspase-1. 半胱天冬酶-1；GSDMD.成孔效應蛋白D；與假手術組比較，(1)P＜0.05；與膿毒癥組比較，(2)P＜0.05達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2)。

圖2 各組小鼠肺組織中CTSB、caspase-1及GSDMD蛋白表達水平比較Fig.2 Comparison of the expression levels of CTSB, caspase-1 and GSDMD protein in lung tissues of mice in each group

3 討 論

Caveolin-1是細胞質(zhì)膜微囊(caveolae)的重要組成部分，在保持微囊完整性、囊泡的運輸及細胞信號傳導中起一定作用。有研究表明，caveolin-1及微囊在免疫細胞中的普遍分布提示它們可能與膿毒癥有關[12]，并且caveolin-1在炎癥反應強烈的區(qū)域表達增多[13]，是反映炎癥損傷的指標。MCPIP1作為一種炎癥信號傳導抑制因子，在維持內(nèi)皮細胞的穩(wěn)態(tài)及功能中起重要作用[14]，是反映組織修復的指標。本研究結果顯示，與假手術組比較，膿毒癥組小鼠肺組織濕/干重比增加，損傷性指標caveolin-1mRNA表達水平增高，修復性指標MCPIP1mRNA表達水平下降，肺損傷評分增加，且出現(xiàn)了豎毛、腹瀉、精神萎靡、活動能力減退等膿毒癥相關癥狀，存活率明顯降低，表明膿毒癥肺損傷模型制備成功。

細胞焦亡是一類由caspase-1介導炎癥介質(zhì)釋放引起的程序性細胞死亡，在感染、炎癥及免疫性疾病中扮演重要的角色[15]。CTSB是一種在多種細胞中廣泛表達的半胱氨酸蛋白水解酶，主要存在于溶酶體中[16]，它能降解通過內(nèi)吞或吞噬作用進入細胞的蛋白，還能降解細胞內(nèi)的細胞器及通過自噬處理的蛋白[17]，參與細胞凋亡、抗原提呈、炎癥反應、細胞自噬及細胞外基質(zhì)降解等多種病理生理過程[18]。在膿毒癥小鼠模型中，中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)導致溶酶體破裂，觸發(fā)CTSB的釋放，誘導NLRP3炎性小體的形成及caspase-1的激活[19]，活化的caspase-1一方面刺激IL-18及IL-1β轉化為成熟的炎性因子[19-20]，另一方面切割GSDMD形成可以在細胞上成孔的GSDMD-N片段，誘導細胞穿孔、破裂，釋放大量炎性介質(zhì)[20]。caspase-1及GSDMD作為細胞焦亡通路的重要介質(zhì)，是評價細胞焦亡的重要指標。本研究結果顯示，與假手術組比較，膿毒癥組CTSB、焦亡相關炎性因子IL-18和IL-1β，以及焦亡相關蛋白caspase-1、GSDMD的表達水平明顯增加，表明CTSB可能在膿毒癥急性肺損傷的肺組織焦亡中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

CTSB是存在于各種生物體內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶，在溶酶體內(nèi)通過激活其他蛋白水解酶系統(tǒng)、活化某些酶原或激素前體肽的方式參與蛋白質(zhì)的加工及降解[21]。異常的CTSB表達增加或激活增強在炎癥、感染、腫瘤及神經(jīng)退行性疾病等病理狀態(tài)下起關鍵作用[10]。因此，CTSB特異性抑制劑的應用為這些疾病的治療提供了新的靶點。目前，通過結構導向設計的CTSB人源化抗體抑制劑(商品名：赫賽汀)已用于乳腺癌的臨床治療。而一種新型的抗體-前肽融合技術，能夠使CTSB抑制劑在納米水平呈現(xiàn)高特異性，也處于研發(fā)階段[22]。由此可見，CTSB抑制劑具有廣泛的臨床應用前景。有研究發(fā)現(xiàn)，CTSB的表達增加促進了NLRP3炎性小體的激活，而使用CTSB抑制劑后，可減輕NLRP3炎性小體的激活[23]。因此，本研究參照文獻的方法，使用10 mg/kg CTSB抑制劑CA-074腹腔注射[24]，探討CTSB在膿毒癥肺損傷中的作用。結果顯示，與膿毒癥組相比，膿毒癥+CA-074組caveolin-1表達水平降低，MCPIP1表達水平升高，肺組織濕/干重比降低，肺損傷評分降低，表明CTSB抑制劑CA-074有改善肺損傷、促進肺組織修復的作用。使用CTSB抑制劑CA-074后，焦亡相關炎性因子釋放減少，焦亡相關蛋白caspase-1及GSDMD表達降低，提示抑制CTSB可阻斷肺組織焦亡途徑，減輕肺損傷。使用CTSB抑制劑CA-074后，與膿毒癥組相比，CTSB蛋白表達降低，而CTSBmRNA無明顯改變，提示CA-074不影響CTSB的轉錄水平，可能參與翻譯水平或者降解途徑的調(diào)節(jié)，具體機制有待后續(xù)進一步研究。CA-074作為CTSB的特異性抑制劑，其減輕肺損傷的機制可能與干擾NLRP3激活，從而抑制焦亡有關。與膿毒癥組相比，膿毒癥+CA-074組小鼠存活率無明顯差異，可能與樣本量太少，或觀察時間過短等原因有關。但本研究尚存在以下不足：(1)僅進行了單次給藥術后24 h的形態(tài)學分析及指標檢測，后續(xù)將對長期用藥實驗后的生存情況及炎癥損傷進行評估。(2)本研究發(fā)現(xiàn)抑制CTSB表達可以減輕肺組織焦亡，但其具體機制仍需要進一步深入研究。

綜上所述，在膿毒癥急性肺損傷中，CTSB表達增高可導致肺組織焦亡，抑制CTSB表達可阻斷肺組織焦亡途徑，從而改善膿毒癥急性肺損傷。