陳小玉，羅連響，潘韻琪，鮑波*

1廣東醫(yī)科大學病理生理學教研室，廣東湛江 524000；2廣東醫(yī)科大學海洋醫(yī)藥研究院，廣東湛江 524000；3廣東醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，廣東湛江 524000

目前，全球約有4700萬人受到神經退行性疾病的影響[1]。在常見的神經退行性疾病中，阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)[2-3]、帕金森病(Parkinson's disease，PD)[4]、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)[5]等的發(fā)病率逐漸升高，且治療效果不佳，造成了巨大的社會和經濟負擔。大腦是一個結構極其復雜的動態(tài)神經功能網絡。目前，人類對于大腦的認識遠遠不夠，即使對于僅為人腦體積數百分之一的嚙齒動物腦的結構和功能機制，也無法進行確切地闡述[6]。在全腦范圍內對特定類型的神經環(huán)路進行高分辨率多維成像，分析病理性結構(如淀粉樣斑塊、神經纖維斑塊纏結)的分布及形態(tài)學變化，對于腦功能及相關疾病的研究至關重要。然而，傳統(tǒng)二維組織切片技術無法客觀地獲得目標區(qū)域真實的立體空間結構，且在機械切片過程中易破壞組織結構的連續(xù)性，導致某些關鍵信息丟失。

組織透明化技術以細胞分辨率對大腦結構進行3D成像，并作為連接影像學成像技術如電子計算機斷層掃描(computed tomography，CT)[7]、正電子發(fā)射型計算機斷層顯像(positron emission computed tomography，PET)[8]、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)[9]與經典顯微組織學和免疫組織化學技術之間的橋梁。為了獲取全腦范圍內神經元的結構形態(tài)和蛋白分布信息，不僅需要具有較高空間分辨率的光學成像系統(tǒng)，同時還需要能夠將大體積樣品進行快速成像的技術。光學顯微鏡如激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)[10]、雙光子激發(fā)熒光顯微鏡(two-photon excitation fluorescence microscopy，TPEFM)[11]和光片熒光顯微鏡(light sheet fluorescence microscope，LSFM)[12]的發(fā)展解決了不同層面焦距變化和成像深度的問題，神經科學家開始嘗試無需切片直接進行3D成像，組織透明化技術由此應運而生。這為優(yōu)化大體積組織成像提供了較好的途徑，可使光線滲透到組織內更深的區(qū)域，在細胞或亞細胞水平提高了成像分辨率和對比度，并逐漸地應用于多個生物醫(yī)學研究領域。本文對腦組織透明化技術的基本原理和特點及其在神經退行性疾病中的應用研究進行綜述。

1 組織透明化技術的原理

由于生物組織結構復雜，含有不同折射率(refraction index，RI)的生物大分子(如脂質、色素、蛋白質復合物等)分布不均，當局部生物大分子聚集較多時，形成了一個特定RI的異質性空間。光通過組織內部時發(fā)生不均勻散射或折射[13]，導致不透明。組織透明化技術通過多種有機化合物或離子去污劑組成混合試劑對生物組織進行一系列處理，以去除、替換或匹配RI不均一的物質，增加組織器官透明度，從而提高光的穿透深度，有利于實現生物組織的空間結構解析和三維重建，其技術流程如圖1所示。

圖1 組織透明化技術工作流程Fig.1 Workflow of tissue clearing techniques

現有透明化方法多通過以下幾種方式：(1)使用洗滌劑和(或)清除劑提高組織通透性；(2)脫脂和脫鈣，去除RI相對較高的成分；(3)脫水，去除RI相對較低的組分，并允許疏水性透明化試劑滲透；(4)變性或消化，將RI大的隔室分解成小而均勻的隔室。為保持組織成分和生物分子自然地分布于三維空間，且同時實現RI均質化，需要借助一些外力，如電泳驅動[14-15]、被動熱擴散[16]和灌注[17]等加壓方式，加速洗滌劑分子移動、化學滲透和去除脂質等成分。對于富含色素或發(fā)色團的有色組織(如黑色素、肌紅蛋白中的血紅素、腦中的脂褐素等)，開發(fā)了包含脫色步驟的組織透明化方法，如CUBIC-L(clear unobstructed brain imaging cocktails of N-butyl-diethanolamine and triton X-100)[18]、PEGASOS[polyethylene glycol(PEG)-associated solvent system][19]。然而，黑色素和脂褐素等大分子色素用有機溶劑或水性試劑很難脫色，DEEPClear(depigmentation-plus-clearing)采用疏水和親水試劑的混合物以及過氧化物漂白步驟，可去除包括黑色素在內的各種色素[20]，為研究各種模式動物的神經網絡和亞細胞結構提供了方案。然而，化學清除劑可能會對組織造成損傷，丟失某些生物分子和亞細胞結構的完整性，故需采取一定的保護性預處理，如固定或網狀凝膠聚合物包埋。Park等[21]利用生物分子與環(huán)氧化物連接的原理開發(fā)了SHIELD(stabilization under harsh conditionsviaintramolecular epoxide linkages to prevent degradation)方法，將組織與柔性聚環(huán)氧化物交聯(lián)，以形成穩(wěn)定性較高、均勻且透明的基質，從而在苛刻的化學/物理處理過程中保護組織結構和熒光蛋白。然而，組織透明化方法中更復雜的作用機制尚不明確，有待進一步研究。

2 透明化技術的代表性方法及其分類

組織透明化技術結合多種熒光標記技術如轉基因動物、病毒示蹤、熒光染料及原位雜交等，可在器官甚至全身水平獲取生物組織的三維結構信息；結合高分辨率光學顯微成像技術，可呈現大腦和脊髓組織中復雜而又緊密連接的三維結構，有助于進一步理解中樞神經與周圍神經、血管的連接機制，為研究中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育、損傷修復、可塑性、神經連接，以及分析各類腦細胞的空間結構等提供了重要工具。

1914年，Spalteholz最先使用有機溶劑苯甲醇和水楊酸甲酯混合透明化試劑，對透明的心臟組織進行3D觀察[22]；2003年，Liu等[23]開發(fā)了使用水溶性化合物進行組織透明化的方法，開拓了近代組織透明化技術發(fā)展的道路；2007年，Dodt等[24]使用苯甲醇-苯甲酸芐酯(BABB)試劑透明新生小鼠大腦得到了透明腦，首次可視化了完整的小鼠大腦神經網絡結構；2013年，Chung和Deisseroth[25]發(fā)明的CLARITY(clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging/immunostaining/in situhybridizationcompatible tissue-hydrogel)透明化技術，出色地展示了將整個生物組織透明后獲得精細圖像的能力。迄今為止，已經開發(fā)了60多種離體組織透明化方法[26]，表1總結了具有代表性的腦透明化方法學參數[17,19,21,25,27-45]，為研究者選用和進一步開發(fā)擴展方法提供簡要索引。

表1 腦組織透明化方法學比較Tab.1 Comparison of methods of brain tissue transparency

根據所用主要試劑的性質，組織透明化技術可分為兩類，即有機溶劑型透明化技術和親水溶劑型透明化技術，其優(yōu)缺點如圖2所示。(1)有機溶劑型透明化技術可將組織在幾天內實現較高地透明度，但內源性熒光信號極易淬滅，如3DISCO(3D imaging of solvent-cleared organs)[28]。近年來開發(fā)了一些新型的有機溶劑透明化技術，如iDISCO(immunolabeling-enabled DISCO)[29]、uDISCO(ultimate DISCO)[30]、vDISCO[nanobody(VHH)-boosted DISCO][46]等，可在一定程度上保存熒光蛋白。(2)親水溶劑型透明化技術，可進一步分類。一類包括ScaleS[33]、SeeDB2(see deep brain)[35]、FOCM[38]等水合溶劑，以良好的熒光保存和維持原組織大小而著稱，通過高濃度透明化試劑CUBIC系列[34,47]簡單孵育可較好地透明化胚胎、新生小鼠大腦或厚切片。另一類包括離子去污劑聯(lián)合水凝膠包被的CLARITY技術[25]及其變體，可以實現完整成年小鼠大腦的高度透明，這極大地拓寬了組織透明化技術研究的范圍，可應用于果蠅、蟑螂、斑馬魚、小鼠、大鼠、兔、狗、狨猴甚至人類的多種組織。

圖2 組織透明化技術的分類及特點Fig.2 Classification and characteristics of tissue clearing techniques

2.1 D I S C O 系列 有機溶劑型透明化技術以3 D I S C O[28]、i D I S C O[29]、P E G A S O S[19]、SHANEL(small-micelle-mediated human organ efficient clearing and labeling)[31]等為代表。技術流程主要包括兩個步驟：脫水/脫脂和高折射率成像介質浸泡。因高折射率成像介質(RI均為1.56左右)與水(RI為1.33)不相溶[48]，首先使用有機溶劑四氫呋喃代替乙醇進行組織脫水，因乙醇會嚴重破壞熒光蛋白信號；脫水后應用脫脂試劑(如BABB、二芐醚)可大幅度提高透明介質向深層組織滲透的效率。此類方法的優(yōu)勢是透明速度快而徹底，透明后的組織變硬，體積縮小，而在中樞神經系統(tǒng)中體積呈等向性縮減，有助于標本長期保存以及多次成像。盡管改進了GFP熒光保存方法，但內源性GFP熒光損傷仍然顯著。此外，因大多數有機溶劑對人體和環(huán)境均具有毒性，使用時需做好生物安全防護措施，廢液應集中處理。DISCO及其衍生方法在透明組織的同時，可進行深層免疫標記，已廣泛應用于成年小鼠腦及全身、人類胚胎、腫瘤活檢樣本、人腦組織等的研究。

2.2 CUBIC系列 親水性組織透明化試劑可高濃度溶解于水，與組織中的蛋白質、水分子等成分形成氫鍵，穩(wěn)定熒光蛋白信號，并保留組織的3D結構，依靠滲透壓驅動逐漸完成透明。常用方法包括ScaleS[33]、CUBIC[34]及SeeDB2[35]等。實驗流程包括脫色、脫脂和RI匹配。此類方法生物安全性更高，具有多種生物兼容性(如親脂性染料)和保留熒光蛋白的優(yōu)勢。由于未去除脂質，透明效果不及疏水性有機溶劑，但可通過延長透明化時間達到良好的透明效果。CUBIC非常適合于光照或給藥后即刻早期基因的檢測，已應用于腦部腫瘤遷移灶、全腦范圍內單個神經元的追蹤、全腦谷氨酸能神經元突觸連接、下丘腦神經元分型及視網膜神經投射等研究。

2.3 CLARITY系列 與其他透明化技術相比，CLARITY系列兼具水溶性透明化方法保持生物分子功能的特性和疏水性方法高效透明的優(yōu)勢，包括PACT-PARS[42]、ACT-PRESTO[44]、SHIELD[22]等。代表性方法CLARITY采用聚丙烯酰胺凝膠，使蛋白質、神經遞質及核酸等生物分子通過化學鍵與水凝膠偶聯(lián)，并將其固定在組織原位，極大地減少了結構破壞，同時凝膠的大分子滲透性支持免疫標記在整個組織中的擴散，且折射率匹配解決方案可通過進一步減少透明和未透明樣品中的光散射來實現深度高分辨率成像。結合示蹤實驗，進行系統(tǒng)性無偏倚地自動化分析，可在高分辨率水平進行單個神經元成像；結合自動化細胞檢測、大腦之間的對齊方式，能快速獲取高通量數據。

3 透明化技術在神經退行性疾病中的應用

組織透明化技術結合多種免疫標記方法，完美地實現了在細胞水平可視化大腦完整結構(如健康人腦皮質中錐體神經元、中間神經元、小腦浦肯野細胞、顆粒細胞等)和功能腦圖譜，以及單個細胞在不同腦區(qū)活動的關聯(lián)等。該技術提供了多維度視角(宏觀和微觀尺度)，可揭示潛在分子標志物在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。通過透明化技術對病理性人腦組織樣本或各種退行性疾病動物模型進行高分辨率成像，如可視化AD的淀粉樣斑塊，PD的多巴胺能軸突、浦肯野細胞、α-突觸核蛋白包涵體，以及MS的腦皮質萎縮和突觸等病理性結構，可在神經環(huán)路水平探究疾病的病理發(fā)展過程。詳見表2。

表2 透明化技術在神經退行性疾病中的應用Tab.2 Application of tissue clearing in neurodegenerative diseases

3.1 AD AD是一種漸進性神經退行性疾病，主要表現為記憶障礙、認知功能障礙及語言障礙，是老年癡呆癥最主要的病因。65歲以上人群患病率為11.3%[2]。AD患者大腦皮質萎縮，神經元長期受β淀粉樣斑塊(amyloid β-protein，Aβ)及神經纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)等侵蝕，突觸功能出現不同程度的紊亂甚至丟失[60]。組織透明化技術直觀地展示了AD病理標志物在三維立體空間中的分布、結構異質性，以及與神經元、膠質細胞、血管等周圍環(huán)境的相互關系，可促進AD病理機制的研究。Hama等[33]開發(fā)ScaleS清除APP轉基因小鼠，結合AbScale深層免疫標記Aβ斑塊，發(fā)現其主要分布于腦皮質；在AD患者腦組織中，致密Aβ斑塊與小膠質細胞毗鄰而存。Vints等[51]使用CUBIC處理25月齡APP轉基因小鼠，結合高爾基-科克斯(Golgi-Cox)與硫代黃素-S染色，解析大腦皮質、海馬區(qū)整個神經元與點狀Aβ斑塊的空間關系。Ando等[52]通過CLARITY獲得了均勻透明的腦組織，結合Aβ、微管相關蛋白Tau和神經絲三重免疫標記，發(fā)現在整個皮質致密實心Aβ大斑塊呈局灶性分布，松散點狀斑塊表現為彌漫性分布，過度磷酸化Tau蛋白則非連續(xù)性聚集于纏結的神經元和Aβ灶性沉積物周圍區(qū)。

為研究斑塊的形成機制，Liebmann等[49]利用iDISCO清除4.4月齡(不含斑塊)到27月齡(斑塊高負荷)的2xTg AD小鼠，精確定位5個腦區(qū)的淀粉樣斑塊沉積的時空順序，其中皮質最先累積，而小腦比海馬更早發(fā)生聚集；Aβ斑塊周圍的小膠質細胞較大，呈巢狀聚集，表明反應性小膠質細胞在募集或轉移斑塊中發(fā)揮作用。此外，研究發(fā)現，小膠質細胞-神經元網絡結構的慢性損傷，將導致AD和PD患者的突觸丟失以及神經元細胞永久性受損[61]。De Rossi等[53]使用被動CLARITY處理5xFAD小鼠腦，對BIN1(bridging integrator 1，一種核質銜接蛋白，參與髓鞘膜的重塑，與遲發(fā)性AD相關)、淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)和β位點APP裂解酶1(beta-site APP-cleaving protease 1，BACE1)進行定位分析，發(fā)現APP和BACE1位于皮質和海馬區(qū)Aβ沉積物周圍的球狀結構中，而BIN1積聚于Aβ病灶附近。該研究明確了BIN1在大腦中的分布及營養(yǎng)不良性神經元中的表達，為AD相關的病理變化提供了新見解。

如何降低Tau蛋白尚不清楚，通過腦內針對性注射藥物試驗，評估不同階段病理性Tau的時空動態(tài)變化及其區(qū)域脆弱性，有望成為臨床前篩選延緩或阻止Tau病理進程藥物的有力工具。Detrez等[50]使用iDISCO+透明衰老Tau.P301L小鼠半腦，在圖譜引導下的體積分析顯示，整個病理性Tau蛋白從注射部位順行或逆行擴散至周邊，也可能波及次級區(qū)域。顱內和全身聯(lián)合給予PT83，可靶向降低胞內磷酸化Tau蛋白水平，推測其機制可能是活化膠質細胞或抑制Tau的相互作用。此外，Martorell等[54]采用SHIELD透明6月齡5xFAD小鼠腦切片，發(fā)現同時使用視覺和聽覺GENUS刺激1周，小鼠整個新皮質的淀粉樣蛋白負荷體積降低了37%，數量減少了34%；單獨使用聽覺GENUS刺激Tau P301S模型小鼠可引起小膠質細胞活化和血管擴張反應，使磷酸化Tau蛋白水平降低。組織透明化技術結合全腦免疫標記提供了檢測大組織樣本的能力，實現了單細胞水平下觀察立體空間結構中各種致病分子與神經細胞間的相互作用，為更客觀地理解神經退行性病變機制提供了一種有效途徑。

3.2 PD PD是常見的第二大中樞神經退行性疾病，以黑質-紋狀體系統(tǒng)病變?yōu)橹?，在我?5歲以上人群中發(fā)病率為1.7%[62]。PD典型的病理學特征是黑質致密部(substantia nigra pars compacta，SNpc)多巴胺能神經元變性丟失，路易小體(Lewy bodies，LBs)異常沉積[4]。在運動控制過程中膽堿能和多巴胺能兩個系統(tǒng)相互拮抗，多巴胺能神經元變性壞死導致紋狀體接收的多巴胺水平降低70%以上時可出現靜止性震顫、肌肉僵直等一系列癥狀；除了多巴胺神經系統(tǒng)外，PD患者前腦膽堿能核團-Meynert基底核(nucleus basalis of meynert，NBM)的膽堿能神經元退化[63]，是導致早期甚至進展期認知功能損傷的主要機制。

目前，已有學者在應用組織透明化技術研究小鼠腦及PD患者多巴胺能神經元多源信息的輸入、整合、編碼、輸出及投射通路方面進行了初步嘗試。Lerner等[56]利用CLARITY透明全腦后，觀察到兩種平行的黑質-紋狀體多巴胺神經元亞群投射的差異性，證實了新的神經回路追蹤和記錄方法，這為完整大腦內豐富的細胞類型及全局連接關系提供了信息。Menegas等[55]使用CLARITY和全腦光片成像，無偏倚地識別了整個SNpc多巴胺神經元亞群中相互平行的輸入回路和輸出回路，揭示了獨立運行的黑質-紋狀體信息流，為理解多巴胺能神經元回路的反饋機制、研究不同類型神經元群的全腦映射提供了一個可推廣的框架。Liu等[57]使用CLARITY技術，通過正交投影圖像表征了PD患者前腦NBM區(qū)域LBs與中腦黑質紋狀體中單胺能神經元纖維的空間分布關系，提示α-Syn可作為病理性“種子”在細胞間沿神經元網絡傳播和擴增，形成特征性的α-Syn聚集體。組織透明化技術在神經環(huán)路水平為分子追蹤提供了可能，可大范圍地研究退行性病變大腦中致病性成分或某一類細胞在整個神經網絡中的作用。

3.3 MS MS是一種病因不明的慢性炎癥性中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘疾病，其晚期典型的病理改變是進行性灰質萎縮，大腦和脊髓出現嚴重脫髓鞘改變，伴有軸索消失、膠質細胞局灶性增生[56]。為更好地了解髓鞘變性和脫髓鞘的機制，髓鞘病理學研究聚焦于軸突-少突膠質細胞-髓鞘單位損傷所涉及的細胞間相互作用。Ertürk等[58]采用3DSICO方法對成年GFP-M小鼠脊髓和腦干進行透明，以評估完整皮質脊髓束(complete corticospinal tract，CST)的軸突再生和神經膠質反應，發(fā)現了損傷1年后具有生長能力的軸突繞過損傷部位大量再生的特征。在完整CNS中可視化細胞，有望用于評估脊髓損傷和其他神經疾病的實驗性療法。Spence等[59]應用改良CLARITY方法清除Thy1-YFP小鼠的完整CNS，揭示了皮質萎縮與軸突末端的突觸小泡存在關系，而與卵圓形軸突無關，表明軸突損傷可能存在可逆性窗口。通過組織透明化技術對嚙齒動物MS模型中完整的腦-脊髓結構進行解析，可在整體水平觀察神經脫髓鞘、軸突以及神經元的病理結構變化，進一步探索潛在的發(fā)病機制，為開發(fā)軸突再生策略和臨床前研究新療法提供技術支持。

此外，組織透明化技術已經應用于人類胚胎學領域，可觀察毫米級3D腦器官的細胞結構[64]。利用DISCO透明技術，實現了妊娠3個月內厘米級人類胚胎的完全透明[65-66]，結合全免疫標記技術發(fā)現，分泌促性腺激素釋放激素的神經元以兩種獨立的途徑遷移，并在下丘腦外的許多大腦區(qū)域定居。研究表明，在10周歲時人腦齒狀回(dentate gyrus，DG)中可觀察到數千個未成熟的神經元[67]，而成人海馬是否有新神經元生成尚需進一步研究。對死后人腦組織的處理方式，在很大程度上阻礙了人類DG中AHN標記物的檢測[68]。組織透明化技術可獲得腦樣本中完整的大腦神經網絡信息，有助于追蹤、評估神經元的變化，因此對觀察死亡后人類腦組織樣本有巨大的潛力，可能為特定病理條件下保存和刺激新神經元的存活和成熟提供新的方法。

4 總結與展望

組織透明化技術因保持了組織標本的完整性，對神經網絡的損壞較小，為實現大體積生物組織的神經、血管等結構的三維可視化及分析研究提供了新的病理診斷視角?？焖俑咝У慕M織透明化方案有利于增加實驗組規(guī)模，以識別較小的生物學效應(如年齡、性別和生活環(huán)境)和微小而重要的臨床差異，并為從細胞水平研究器官結構提供了新的方向，且有望為神經退行性疾病的精準治療提供可能。

目前，大多數透明化方法基于嚙齒類動物大腦，雖為人腦透明化的可行性提供了理論驗證，但要實現人類大腦全面的神經回路分析，仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。現有透明化技術對完整組織器官的透明及成像效果仍有待提高，如超快的清除速度、整體器官的高透明度、親脂性染料(用于追蹤神經元結構和脈管系統(tǒng))的兼容性以及生物安全性等。此外，還需要對成像技術、數據處理加以改善。首先，較大體積的組織需要工作距離更長、視野更大的光學顯微鏡，有的顯微鏡功能并非完全兼容，且圖像采集效率較低。目前，光片熒光顯微鏡成像系統(tǒng)提供了有前途的解決方案，未來期待能實現任意大小組織亞微米級分辨率的光學顯微鏡，以打破三維成像中組織體積以及分辨率的限制。其次，數據存儲和處理方面要求大容量智能化，因大規(guī)模體積成像期間會生成千兆字節(jié)甚至TB級數據集，手動提取分析有意義的數據較為困難。因此，高性能工作站對于數據存儲和分析確實是必需的。

綜上所述，不同學科組織透明化方法的融合，為無偏倚3D組織成像鋪平了道路，將促進組織透明化技術更廣泛地應用，如作為藥物向中樞神經系統(tǒng)轉運新的定量分析工具等。靶向神經系統(tǒng)的生物制劑或其他大分子藥物如何克服血腦屏障和其他可能限制療效的微環(huán)境，仍需進一步深入探討。組織透明化技術可在保持結構完整性和蛋白質免疫原性的同時使腦組織足夠透明，能高分辨率地獲取藥物的生物分布及單細胞水平的作用靶點，針對此特性的研究為了解藥物作用的分子機制、開發(fā)新型高效藥物提供了重要數據，可能為生物制藥帶來突破性變革。