鄒進(jìn)晶，陳國(guó)忠

武漢大學(xué)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，武漢 430060

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族含熱蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domaincontaining protein 3，NLRP3)炎性小體是機(jī)體固有免疫的重要組成部分，可識(shí)別細(xì)胞內(nèi)病原相關(guān)分子模式或損傷相關(guān)分子模式，介導(dǎo)多種細(xì)胞因子的加工、成熟及釋放，包括白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β及IL-18，直接參與調(diào)控多種慢性炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[1-3]。NLRP3炎性小體主要由NLRP3、凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated specklike protein containing a CARD，ASC)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)組成。NLRP3蛋白能感知信號(hào)刺激并作為支架蛋白結(jié)合ASC，ASC招募并水解caspase-1前體(pro-caspase-1)，形成具有酶活性的caspase-1，促進(jìn)IL-1β及IL-18等炎性因子的加工、成熟及釋放[4]。本文就NLRP3炎性小體的活化機(jī)制及其在慢性氣道炎癥性疾病如慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和哮喘中的作用綜述如下。

1 NLRP3炎性小體

1.1 NLRP3炎性小體活性調(diào)控 NLRP3炎性小體的活性調(diào)控可通過(guò)多種方式實(shí)現(xiàn)，如通過(guò)細(xì)胞膜表面Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)或細(xì)胞因子受體[如腫瘤壞死因子受體、IL-1受體(IL-1 receptor，IL-1R)]激活下游核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，直接促進(jìn)NLRP3及IL-1β前體(pro-IL-1β)轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄水平激活NLRP3炎性小體。目前認(rèn)為NLRP3炎性小體活化還與離子流、溶酶體損傷及細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的形成有關(guān)(圖1)。

圖1 NLRP3炎性小體活性調(diào)控過(guò)程Fig.1 Regulation of NLRP3 inflammasome activity

1.1.1 離子流 胞漿離子濃度改變與NLRP3炎性小體的功能密切相關(guān)。研究顯示，細(xì)胞內(nèi)K+減少及Ca2+增加均可改變NLRP3炎性小體的活性。由于細(xì)胞損傷或其他原因造成細(xì)胞外三磷酸腺苷(extracellular adenosine triphosphate，eATP)水平升高，可與嘌呤能P2X7受體結(jié)合，觸發(fā)K+快速外流，導(dǎo)致代償性Ca2+內(nèi)流以及細(xì)胞膜縫隙連接蛋白半通道蛋白Pannexin-1開放，后者能介導(dǎo)多種小分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而直接激活NLRP3炎性小體[5]。除ATP外，穿孔素也可直接在細(xì)胞膜上打孔，造成細(xì)胞內(nèi)K+外流并促進(jìn)細(xì)胞外脂多糖等分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而刺激NLRP3炎性小體活化。細(xì)胞膜表面的鈉鉀泵是向細(xì)胞內(nèi)泵入K+的關(guān)鍵機(jī)制之一，抑制鈉鉀泵可降低細(xì)胞內(nèi)K+水平，從而激活NLRP3炎性小體[6]。但目前K+外流引起NLRP3炎性小體激活的具體機(jī)制尚不明確。Iyer等[7]認(rèn)為，K+外流可能促進(jìn)線粒體膜脂質(zhì)心磷脂釋放，并與NLRP3蛋白C末端富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeat，LRR)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，進(jìn)而激活NLRP3炎性小體。此外，細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加也與NLRP3炎性小體激活有關(guān)。Ca2+可與細(xì)胞膜表面的鈣敏感受體結(jié)合，促進(jìn)磷脂酶C催化細(xì)胞膜上的4,5-二磷酸磷脂酰肌醇生成1, 4, 5-三磷酸肌醇，后者與其特異性受體結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；Ca2+還可直接促進(jìn)NLRP3與ASC的結(jié)合，從而激活NLRP3炎性小體[8]。

1.1.2 溶酶體損傷 晶體物質(zhì)(如尿酸鹽、草酸鈣、硅、鋁等)及纖維蛋白(如β-淀粉樣蛋白)能被免疫細(xì)胞吞噬，破壞細(xì)胞溶酶體穩(wěn)定性及膜通透性，釋放溶酶體內(nèi)多種組織蛋白酶(如組織蛋白酶B、L、C、S等)，進(jìn)而激活NLRP3炎性小體[8]。直接應(yīng)用組織蛋白酶B抑制劑能減弱NLRP3炎性小體的活化及caspase-1活性；而應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑抑制酸依賴的溶酶體蛋白酶也能明顯抑制NLRP3炎性小體的活化過(guò)程[10]。目前，溶酶體損傷影響NLRP3炎性小體激活的具體機(jī)制尚不明確。有研究顯示，溶酶體釋放的組織蛋白酶能水解并降低NLRP3炎性小體內(nèi)源性抑制因子水平，或直接作為配體發(fā)揮對(duì)NLRP3炎性小體的活化作用[11]。此外，溶酶體破裂還會(huì)釋放Ca2+，促進(jìn)ASC寡聚化及其與NLRP3的結(jié)合，從而激活NLRP3炎性小體[12]。

1.1.3 細(xì)胞內(nèi)ROS形成 細(xì)胞內(nèi)ROS可使硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，T X N I P)與硫氧還蛋白解離，并促進(jìn)T X N I P 與NLRP3的LRR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而解除LRR依賴的NLRP3自身抑制作用。線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS的重要來(lái)源，線粒體ROS可刺激NLRP3定位到線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes，MAM)，同時(shí)ASC也被招募至MAM，與NLRP3、pro-caspase-1等一起組裝形成NLRP3炎性小體[13]。應(yīng)用ROS清除劑或NADPH氧化酶抑制劑能明顯阻斷NLRP3炎性小體的活化。

與NLRP3炎性小體激活過(guò)程相似，其活性抑制機(jī)制也十分復(fù)雜。雌激素及鋅指蛋白GFⅡ等可直接抑制NF-κB活性，在轉(zhuǎn)錄水平減少NLRP3的轉(zhuǎn)錄，而miR-223能直接與NLRP3mRNA的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)NLRP3mRNA降解[14-15]。細(xì)胞內(nèi)cAMP通過(guò)與NLRP3的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)相互作用，而一氧化氮?jiǎng)t通過(guò)誘導(dǎo)NLRP3亞硝基化干擾NLRP3炎性小體組裝，從而阻止其活化[16-17]。此外，細(xì)胞內(nèi)一氧化氮還能促進(jìn)損傷線粒體的清除，從而抑制NLRP3炎性小體的激活[18]。

1.2 N L R P 3 炎性小體的肺內(nèi)表達(dá) 既往有關(guān)NLRP3炎性小體的研究大多集中于骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞，但Guarda等[19]應(yīng)用熒光示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，肺是除脾臟以外NLRP3表達(dá)水平最高的組織。肺內(nèi)高水平NLRP3表達(dá)可能與肺內(nèi)存在的大量免疫細(xì)胞有關(guān)。事實(shí)上，肺泡巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞中NLRP3表達(dá)水平很高，是肺組織IL-1β及IL-18的主要來(lái)源。此外，肺上皮細(xì)胞也表達(dá)NLRP3并在應(yīng)激刺激下分泌IL-1β[20]。肺內(nèi)高水平的NLRP3炎性小體表達(dá)與肺內(nèi)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，下面將對(duì)NLRP3在COPD及哮喘這兩種慢性氣道炎癥性疾病中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2 NLRP3炎性小體與常見慢性氣道炎癥性疾病

2.1 COPD COPD是一種不完全可逆的以持續(xù)性氣流受限為主要特征的慢性進(jìn)行性肺病，可逐漸發(fā)展為肺源性心臟病及呼吸衰竭。COPD的確切原因目前尚不明確，但大量研究證實(shí)，氣道免疫炎癥反應(yīng)與COPD的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。吸入有毒有害顆粒或氣體(主要為吸煙)是COPD發(fā)生及氣道炎癥加劇的重要原因。這些有毒有害顆?；驓怏w作用于肺內(nèi)上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等，加速炎性因子、ROS及組織降解酶的合成釋放，促進(jìn)炎癥發(fā)展及肺結(jié)構(gòu)破壞。既往研究發(fā)現(xiàn)，吸入的有毒有害顆?；驓怏w可直接激活肺內(nèi)模式識(shí)別受體(主要為TLR)，進(jìn)而激活下游NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)NLRP3及相關(guān)炎性因子的轉(zhuǎn)錄。此外，這些有毒有害顆?；驓怏w還會(huì)引起肺內(nèi)細(xì)胞大量死亡，釋放多種內(nèi)源性危險(xiǎn)分子，如高遷移率族蛋白B1等，進(jìn)一步促進(jìn)TLR及下游NLRP3的活化[21]。由于胞外核苷酸酶的存在，eATP常處于較低水平，但對(duì)于COPD患者，由于胞外核苷酸酶表達(dá)下調(diào)或上皮及白細(xì)胞來(lái)源的ATP增多，導(dǎo)致eATP水平升高，進(jìn)而通過(guò)P2X7受體激活NLRP3炎性小體。而且，eATP還能通過(guò)P2X7受體促進(jìn)炎癥細(xì)胞趨化及活化，進(jìn)一步加重肺內(nèi)炎癥反應(yīng)[22]。有研究顯示，COPD患者肺內(nèi)ATP水平與肺功能及炎癥水平顯著相關(guān)[23]。

氧化應(yīng)激是NLRP3炎性小體活化的另一關(guān)鍵機(jī)制。大量研究證實(shí)，在COPD發(fā)生及加重過(guò)程中，肺內(nèi)ROS水平顯著增高；氣道免疫細(xì)胞浸潤(rùn)還會(huì)進(jìn)一步增加肺內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生及氧化應(yīng)激反應(yīng)。尿酸單鈉晶體也是NLRP3活化的重要分子，可被肺泡巨噬細(xì)胞攝取，直接誘導(dǎo)NLRP3炎性小體活化，而敲除NLRP3可抑制小鼠IL-1β的產(chǎn)生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。大量研究證實(shí)，COPD患者的肺泡灌洗液中尿酸水平顯著升高，提示尿酸也可能參與調(diào)控NLRP3的活化[24]。此外，COPD患者肺組織caspase-1活性、IL-1β及IL-18等炎性因子水平也顯著增高，提示NLRP3炎性小體在COPD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中被激活。

目前關(guān)于NLRP3炎性小體在COPD進(jìn)展中作用的研究較少。Lappalainen等[25]發(fā)現(xiàn)，肺上皮細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)IL-1β的小鼠肺內(nèi)中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多，肺泡間隔彈力纖維被嚴(yán)重破壞，氣道壁發(fā)生纖維化，肺遠(yuǎn)端小氣道出現(xiàn)擴(kuò)張，表現(xiàn)出與COPD相似的病理改變及功能障礙。敲除IL-1R或應(yīng)用IL-1β中和抗體能阻斷吸煙引起的肺病理改變[26]。此外，過(guò)表達(dá)IL-18也可增加小鼠肺內(nèi)炎癥水平，促進(jìn)小鼠肺氣腫及肺動(dòng)脈高壓形成，與COPD的臨床表現(xiàn)一致；而敲除IL-18受體則能顯著減輕吸煙引起的小鼠肺損傷及炎癥反應(yīng)[27-28]。同樣，應(yīng)用caspase-1特異性抑制劑也能減少吸煙誘導(dǎo)的小鼠肺內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并降低血清炎性因子IL-1β、TNF-α水平[29]。Eltom等[30]研究發(fā)現(xiàn)，使用P2X7受體選擇性抑制劑或敲除P2X7受體能抑制吸煙誘導(dǎo)的小鼠caspase-1活化及IL-1β釋放，減少氣道中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)并緩解小鼠COPD癥狀。但Pauwels等[26]分別應(yīng)用NLRP3及caspase-1敲除小鼠進(jìn)行研究卻發(fā)現(xiàn)，吸煙引起的肺內(nèi)炎癥損傷與NLRP3及caspase-1無(wú)關(guān)。

2.2支氣管哮喘 支氣管哮喘是由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分引起的氣道慢性炎癥及高反應(yīng)性[31]，主要表現(xiàn)為廣泛而多變的可逆性呼氣氣流受限。研究顯示，哮喘致病源塵螨可促進(jìn)巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞釋放ATP，激活NLRP3炎性小體，增強(qiáng)氣道炎癥反應(yīng)；在哮喘患者肺內(nèi)也可檢測(cè)到較高的ATP及其受體P2X7水平[32]。過(guò)敏原吸入還會(huì)促進(jìn)氣道ROS的產(chǎn)生，進(jìn)一步激活NLRP3炎性小體，增加IL-1β和IL-18的成熟及釋放。此外，二氧化硅及石棉等還能促進(jìn)NLRP3炎性小體組裝，以增加其活性[33]。研究顯示，卵清蛋白引起的哮喘小鼠的血清中淀粉樣蛋白A水平顯著升高，可直接激活NLRP3炎性小體，加重哮喘癥狀[34]。在卵清蛋白及氧化鋁誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中可檢測(cè)到caspase-1活性及IL-1β水平升高，且氣道IL-1β水平與caspase-1活性呈正相關(guān)[35]。在哮喘患者痰液中也可檢測(cè)到高水平的IL-1β，并與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)[36]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在兒童急性哮喘及哮喘患者的支氣管肺泡灌洗液中IL-18水平明顯降低[37-38]。

中和肺內(nèi)ATP或應(yīng)用非選擇性嘌呤能受體拮抗劑可減輕卵清蛋白及氧化鋁誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生及氣道高反應(yīng)性[39]。應(yīng)用caspase廣譜抑制劑也可減輕哮喘小鼠的氣道炎癥反應(yīng)[32]。通過(guò)重組腺病毒過(guò)表達(dá)IL-1受體拮抗劑或直接敲除IL-1α/β能顯著降低過(guò)敏原引起的小鼠氣道高反應(yīng)性，以及中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞附著，而且氣道周圍炎癥也得以減輕[40-41]。Th2細(xì)胞與支氣管哮喘的關(guān)系密切，可通過(guò)致敏嗜酸性粒細(xì)胞而增高氣道反應(yīng)性。敲除NLRP3、ASC或caspase-1可抑制Th2細(xì)胞活化，減少氣道嗜酸性粒細(xì)胞及Th2細(xì)胞釋放相關(guān)炎性因子；相應(yīng)地，敲除IL-1β或IL-1R也可明顯抑制小鼠氣道Th2細(xì)胞活化[42-43]。但Kool等[44]卻認(rèn)為，NLRP3與卵清蛋白或塵螨引起的氣道炎癥反應(yīng)無(wú)關(guān)。Allen等[45]使用4種不同的過(guò)敏性哮喘模型也證實(shí)，敲除NLRP3不影響小鼠氣道過(guò)敏反應(yīng)。這些差異可能與過(guò)敏原類型、濃度、給藥方式及宿主微生物組成不同有關(guān)，但NLRP3在哮喘中的作用還需進(jìn)一步研究。IL-18可以促進(jìn)Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-9及IL-13，肺特異性過(guò)表達(dá)IL-18可增加卵清蛋白誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及高反應(yīng)性，應(yīng)用抗CD4抗體處理或敲除IL-13則能改變小鼠的氣道炎癥及哮喘癥狀[46]。反之，敲除IL-18可顯著緩解卵清蛋白或氧化鋁誘導(dǎo)的小鼠哮喘癥狀[47]。也有研究發(fā)現(xiàn)，IL-18與哮喘的發(fā)生無(wú)關(guān)，甚至可以抑制哮喘的進(jìn)展[48-49]。

3 總結(jié)與展望

NLRP3炎性小體是機(jī)體固有免疫的重要組成部分，與多種慢性炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。NLRP3炎性小體在肺內(nèi)高表達(dá)，參與調(diào)控COPD及哮喘等慢性氣道炎癥性疾病的進(jìn)展。目前關(guān)于NLRP3炎性小體在上述疾病中作用的研究較少，其機(jī)制也尚未完全明確，如慢性氣道炎癥性疾病進(jìn)展過(guò)程中NLRP3炎性小體活化的具體方式是在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生，還是依賴于經(jīng)典的離子流、溶酶體損傷或細(xì)胞內(nèi)ROS等仍需進(jìn)一步探討。此類疾病進(jìn)展通常涉及多種細(xì)胞類型，NLRP3炎性小體主要表達(dá)于肺內(nèi)何種細(xì)胞，在不同類型細(xì)胞中對(duì)病情進(jìn)展的影響是否一致也不明確。后續(xù)研究可通過(guò)譜系追蹤實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)基因小鼠探討NLRP3炎性小體在不同慢性氣道炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。