郭勇亮（天津市北辰醫(yī)院,天津 300400）

2020年全球范圍內(nèi)的腫瘤流行病學(xué)研究顯示，2018年全世界新增結(jié)直腸癌（CRC）病例超過180萬例，死亡病例為88.1萬[1]。目前，大多數(shù)研究證實(shí)，CRC是由結(jié)直腸腺瘤逐步發(fā)展演化而來，但其進(jìn)展為癌的分子機(jī)制并未完全清晰。隨著分子生物學(xué)和高通量技術(shù)的進(jìn)步，更多的證據(jù)指向多基因集的時(shí)空表達(dá)失調(diào)在CRC發(fā)生中發(fā)揮重要機(jī)制[2]。本研究采用生物信息分析技術(shù)，探討結(jié)直腸癌差異表達(dá)基因篩選及其與患者預(yù)后關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究的設(shè)計(jì)思路為首先在結(jié)直腸癌與正常腸上皮差異表達(dá)的多個(gè)數(shù)據(jù)集中篩選出差異表達(dá)基因譜系，并對共差異表達(dá)基因進(jìn)行鑒定；然后對共差異表達(dá)基因進(jìn)行拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析、GO+KEGG分析富集和hub基因篩選；對篩選出的hub基因分析其與CRC生存的關(guān)系，具體設(shè)計(jì)和實(shí)施見圖1。

圖1 研究分析的流程圖

1.2 數(shù)據(jù)及材料 基因綜合表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）、蛋白互相作用拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（STRING）、腫瘤生存分析數(shù)據(jù)庫（Kaplan-Meier），作為本次研究的主要數(shù)據(jù)來源。

1.3 方法 GEO數(shù)據(jù)庫中檢索CRC基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，檢索詞為“colorectal cancer/colon cancer/rectal cancer”，種屬為“homo”。進(jìn)一步對檢索到的結(jié)果進(jìn)行篩選，選取了GSE32323[3]、GSE21510[4]和GSE9348[5]數(shù)據(jù)為研究對象三個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。根據(jù)數(shù)據(jù)集中CRC患者結(jié)直腸癌組織與正常腸上皮組織中基因表達(dá)譜情況進(jìn)行篩選，篩選條件為CRC組和正常組中上調(diào)或下調(diào)超過2個(gè)拷貝的基因，且P＜0.05；分別對上述數(shù)據(jù)集中篩查出的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，鑒定出共差異基因，并繪制Venn圖。在STRING數(shù)據(jù)庫中對篩選出的共差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白相互作用拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，構(gòu)建條件為：數(shù)據(jù)來源Textmining，co-expression，gene function 和co-occurrence；相互作用關(guān)系系數(shù)≥0.4；相互作用蛋白不高于20個(gè)。在KEGG數(shù)據(jù)庫中對篩選出的差異表達(dá)基因相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行富集分析。采用Cytoscapev3.7.2軟件對拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中的hub基因篩選關(guān)鍵hub基因，篩選依據(jù)為node-score。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究涉及的數(shù)據(jù)采用R軟件及對應(yīng)的統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行分析，計(jì)量資料應(yīng)用±s表示，應(yīng)用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)采用率表示，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC差異表達(dá)基因篩選 選取了GSE32323、GSE21510和GSE9348數(shù)據(jù)為研究對象，3個(gè)數(shù)據(jù)集基本特征見表1。3個(gè)數(shù)據(jù)集中共差異表達(dá)的基因?yàn)?3個(gè)（見圖2）。

表1 納入分析的4個(gè)數(shù)據(jù)基本特征

圖2 CRC差異表達(dá)基因篩選火山圖和Venn圖（A：GSE32323數(shù)據(jù)集；B：GSE9348數(shù)據(jù)集；C：GSE21510數(shù)據(jù)集；D：3個(gè)數(shù)據(jù)集Venn圖）

2.2 差異表達(dá)基因GO及KEGG分析 23個(gè)差異表達(dá)基因GO分析主要富集于DNA聚合酶活性的正向調(diào)節(jié)、核苷酸切除修復(fù)；DNA缺口填充、染色體復(fù)制叉；DNA酶活性和ATP結(jié)合等（見表2）；KEGG信號(hào)通路主要富集于消化系統(tǒng)腫瘤、JAK-STAT信號(hào)通路和趨化因子信號(hào)通路等（見表3）。

表2 差異表達(dá)基因GO富集

表3 KEGG信號(hào)通路富集

2.3 差異表達(dá)基因聚類熱圖分析 根據(jù)CRC與正常肝組織23個(gè)差異基因表達(dá)水平繪制聚類熱圖，CRC腫瘤組織與正常組織間聚類明顯，見圖3。

圖3 CRC差異表達(dá)的23個(gè)基因聚類熱圖

2.4 PPI拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)及hub基因 23個(gè)CRC與正常腸上皮組織差異表達(dá)基因繪制PPI拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中有43個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)，75個(gè)作用關(guān)系，平均作用度為3.49，區(qū)域聚類指數(shù)為0.417。Cytoscapev3.7.2軟件對拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中的hub基因進(jìn)行篩選，RFC5為23個(gè)差異基因中的關(guān)鍵hub基因，見圖4。

圖4 37個(gè)差異表達(dá)基因PPI拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)及hub基因

2.5 hub基因與CRC預(yù)后分析 RFC5（HR=0.60，P=0.019）和RFC1（HR=0.58，P=0.017）高表達(dá)組OS顯著高于低表達(dá)組，其有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；而RFC5和RFC1高表達(dá)組PFS與低表達(dá)組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖5。

圖5 三個(gè)hub基因差別與CRC預(yù)后關(guān)系的生存曲線

3 討論

2015年中國新增結(jié)直腸癌患者約37.6萬例，結(jié)直腸癌死亡患者約19.1萬例，占惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的五分之一[6]。近年來雖然CRC的診斷方面取得了重大進(jìn)展，但在CRC確診時(shí)大多數(shù)患者已發(fā)展為中晚期，預(yù)后較差。目前，大多數(shù)研究證實(shí)，結(jié)直腸癌是由結(jié)直腸腺瘤逐步發(fā)展演化而來，但其進(jìn)展為癌的分子機(jī)制并未完全清晰。隨著分子生物學(xué)和高通量技術(shù)的進(jìn)步，更多的證據(jù)指向多基因集的時(shí)空表達(dá)失調(diào)在CRC發(fā)生中發(fā)揮重要機(jī)制。高通量測序（如微陣列和RNA測序）的轉(zhuǎn)錄組分析被認(rèn)為是癌癥研究中很有前途的工具，可以識(shí)別候選預(yù)后和診斷生物標(biāo)志物的通路和基因[7]。此外，這些生物標(biāo)志物可能為改善CRC的預(yù)防和治療帶來突破性進(jìn)展。近年來，對基因表達(dá)數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析探索了CRC潛在的基因生物標(biāo)志物，但有時(shí)生物信息學(xué)結(jié)果并不完全一致[8-9]。在此背景下，將多個(gè)分子生物檢測結(jié)果進(jìn)行匯總分析有望提高結(jié)論的可靠性。此外，在CRC中已經(jīng)從微陣列數(shù)據(jù)集中識(shí)別出大量的DEG。然而，尚未完全了解DEGs在CRC進(jìn)展相關(guān)的分子機(jī)制和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的作用。

在本研究中，對3個(gè)CRC數(shù)據(jù)集進(jìn)行了綜合分析，篩選出了共差異表達(dá)基因，并對共差異基因進(jìn)行了功能富集、信號(hào)通路及與患者預(yù)后相關(guān)性研究。結(jié)果顯示，GSE32323、GSE21510和GSE9348數(shù)據(jù)中共差異表達(dá)的基因?yàn)?3個(gè)，RFC5為23個(gè)差異基因中的關(guān)鍵hub基因；RFC5（HR=0.60，P=0.019）和RFC1（HR=0.58，P=0.017）高表達(dá)組OS顯著高于低表達(dá)組，其有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；而RFC5和RFC1高表達(dá)組PFS與低表達(dá)組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。研究認(rèn)為，RFC5和RFC1可能與CRC的發(fā)生有關(guān)，并可作為CRC預(yù)后良好的分子標(biāo)志物。

RFC1和RFC5為RFC家族成員，RFC是一個(gè)五亞基的蛋白復(fù)合物，是DNA復(fù)制所必需的。這個(gè)異五聚體的亞基被命名為RFC1、RFC2、RFC3、RFC4和RFC5[10]。RFC與DNA的3'端結(jié)合同時(shí)利用ATP打開PCNA的環(huán)并包圍DNA，為后續(xù)DNA復(fù)制提供條件。據(jù)報(bào)道，RFC在多種惡性腫瘤中具有生物學(xué)活性，可能在腫瘤的增殖、進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[10]。根據(jù)腫瘤的細(xì)胞和組織學(xué)特征，它可以作為癌基因或抑癌基因[11-14]。筆者發(fā)現(xiàn)，RFC1和RFC5高表達(dá)的CRC患者，OS存在明顯優(yōu)勢，但DFS無差異。結(jié)果提示，RFC1和RFC5有可能成為CRC潛在的預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物，同時(shí)也為CRC的靶向治療提供的新的潛在靶點(diǎn)。