方 晉，朱平平，彭慧倩，覃智恒，劉育文，彭 穎

(南華大學藥學院，湖南 衡陽 421001)

艾葉，為菊科蒿屬植物艾ArtemisiaargyiLevl.etVant.的葉，味辛、苦，性溫，有溫經止血、祛濕止癢、散寒止痛等功效[1]。艾葉廣泛分布于亞洲東部，全草入藥，是我國傳統的預防鼠疫、炎癥、癌癥、痛經等疾病的中草藥[2-3]。此外，艾葉還可用于艾灸、驅趕蚊蟲，用艾水洗澡或熏蒸可止癢消毒、防治皮膚病[4]?，F代藥理研究表明，艾葉的主要化學成分為多糖、黃酮、揮發(fā)油及三萜類，藥理作用較廣[5-6]。其中，艾葉多糖具有抗菌消炎、抗氧化、免疫調節(jié)等作用，具有廣泛的應用前景[7-8]。本文通過單因素考察，對苯酚-濃硫酸法測定艾葉多糖含量的顯色條件進行了優(yōu)化，并進一步探究了紫外分光光度法測定艾葉多糖含量的可行性，可為后續(xù)艾葉多糖的提取研究和開發(fā)利用提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

FA224電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；UV-2450紫外分光光度計，島津企業(yè)管理有限公司；SY-1220恒溫電熱水浴鍋，美國精騏有限公司。

艾葉，湖北蘄陽河蘄艾科技有限公司；葡萄糖標準品，上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇，湖南匯虹試劑有限公司；苯酚，國藥集團化學試劑有限公司；濃硫酸，湖南匯虹試劑有限公司；純凈水，實驗室自制。

1.2 試液配制

1.2.1 艾葉供試品試液的配制

精密稱取粉碎后的艾葉粉末5 g置于圓底燒瓶內，按料液比1:25加入125 mL 40%的乙醇溶液，加熱至91 ℃保持微沸狀態(tài)回流2 h，趁熱抽濾，濾液倒入具塞錐形瓶內，置于冰箱備用。移取以上艾葉提取液1 mL，放置于25 mL容量瓶中，使用純凈水稀釋定容，作為艾葉供試品試液。

1.2.2 葡萄糖標準品試液的配制

精密稱取葡萄糖標準品0.0113 g置于50 mL容量瓶中并加入純凈水定容，作為葡萄糖標準品試液。

1.3 苯酚-濃硫酸法測定艾葉多糖含量的最適條件考察

1.3.1 苯酚-濃硫酸法

精密移取稀釋后的艾葉供試品試液1.0 mL，放于20 mL的具塞比色管中，加入純凈水補至2 mL。同時加入5%的苯酚溶液1.0 mL，快速振蕩均勻，后迅速沿管壁加入濃硫酸7 mL，靜置10 min后置于40 ℃水浴鍋中加熱30 min，取出后迅速冰浴3 min，再保持在室溫下靜置30 min，用紫外分光光度計測定吸光度值[9-10]。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 取樣量考察

艾葉供試品試液取樣量分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mL，其他操作同“1.3.1”。實驗表明，取樣量為1.0 mL時吸光度為0.289，在0.2～0.8之間可滿足朗伯比爾定律紫外吸光度測定要求，故艾葉供試品取樣量可定為1.0 mL。

表1 取樣量考察

1.3.2.2 苯酚用量考察

5%苯酚用量分別取0.4、0.7、1、1.3、1.6 mL，其他操作同“1.3.1”。結果表明，苯酚取1.0～1.3 mL時，吸光度數據接近。為節(jié)省苯酚用量，可選用1.0 mL作為適宜的苯酚用量。

圖1 苯酚用量考察

1.3.2.3 濃硫酸用量考察

濃硫酸用量分別取5、6、7、8 mL，其他操作同“1.3.1”。實驗表明濃硫酸用量為7 mL、8 mL時吸光度A數據接近，為節(jié)省硫酸用量，適宜的硫酸用量選用7 mL。

圖2 濃硫酸用量考察

1.3.2.4 水浴溫度考察

水浴溫度分別為20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃，其他操作同“1.3.1”。實驗表明水浴溫度為40 ℃時為宜。

圖3 水浴溫度考察

1.3.2.5 水浴時間(反應時間)考察

水浴時間分別為10、20、30、40、50 min，其他操作同“1.3.1”。實驗表明水浴時間對實驗結果影響并不大，故可選用20 min作為反應時間。

圖4 水浴時間考察

1.3.2.6 靜置狀態(tài)考察

通過查閱藥典以及文獻可知，水浴后有迅速冰浴降至室溫以及在室溫下冷卻兩種方法，本研究據此進行考察，其他操作同“1.3.1”。實驗表明冰浴或室溫冷卻的吸光度值數據接近，但為防止季節(jié)性室溫不同的干擾，選用冰浴條件可以控制實驗條件的一致性。

表2 靜置狀態(tài)考察

1.3.2.7 紫外檢測前最短等待時間考察

根據預實驗以及查閱文獻后可知，在冰浴冷卻后的30 min內，溶液能夠逐漸變得澄清，吸光度變化較大[11]。故本研究考慮存在紫外檢測前最短等待時間這一影響因素，并設計了以下考察試驗。

冰浴后分別在室溫下靜置10、20、30、40、50 min，其他操作同“1.3.1”。實驗表明冰浴后等待30 min以上吸光度A趨于穩(wěn)定，故冰浴后適宜等待30 min，再于紫外分光光度計下進行吸光度A的測定。

圖5 紫外檢測前最短等待時間考察

1.3.2.8 產物穩(wěn)定性(紫外檢測前最長等待時間)考察

苯酚-濃硫酸法作用原理為生成橙黃色化合物的顯色反應[12]。而產物穩(wěn)定性考察是為了探究從冰浴結束到利用紫外分光光度計測定吸光度的最長時間。如果產物在一定時間內發(fā)生降解變質等反應，則需要控制最遲測定時間，以避免實驗誤差的產生。

分別在冰浴結束1 h、2 h、4 h、8 h、24 h后，利用紫外分光光度計測定吸光度A值，其他操作同“1.3.1”。根據實驗數據可知，顯色反應產物在4 h內穩(wěn)定，故應該控制反應后4 h內于紫外分光光度計下測定吸光度A值。

圖6 紫外檢測前最長等待時間考察

1.3.3 總結苯酚-濃硫酸法測定艾葉總多糖最優(yōu)實驗條件

綜上所述，處理艾葉多糖的最優(yōu)顯色條件為：精密移取稀釋后的艾葉供試品試液1.0 mL，放于20 mL的具塞比色管中，加入純凈水補至2 mL。同時加入含量為5%的苯酚溶液 1.0 mL，快速振蕩均勻，后迅速順著管壁加入濃硫酸7 mL，靜置10 min后置于40 ℃水浴鍋中加熱20 min，取出后迅速冰浴3 min，再保持在室溫下靜置30 min，并應在冰浴結束4 h內，用紫外分光光度計測定吸光度值。

1.4 紫外分光光度法測定艾葉總多糖含量系統方法學考察

1.4.1 專屬性考察

分別對空白試劑(純凈水)、葡萄糖標準品試液、艾葉供試品試液，按“1.3.3”項下最適苯酚-濃硫酸法進行顯色，同時取未經顯色處理的艾葉供試品試液，利用紫外可見分光光度計在600～200 nm波長范圍內對上述四種試液進行光譜掃描，結果為圖7所示，選擇葡萄糖標準品的最大吸收波長487 nm作為本系統方法學考察的測定波長。

圖7 專屬性考察光譜圖

1.4.2 線性范圍考察

分別依次移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖標準品試液于20 mL具塞比色管中，按“1.3.3”項下最適苯酚-濃硫酸法進行顯色。用空白試液調零，在波長487 nm處測定吸光度，并繪制標準曲線。由圖8可得，本實驗條件下線性回歸方程為y=1.5764x+0.0145，r=0.9996，表明葡萄糖濃度在22.6～226 μg/mL范圍內與吸光度值的線性關系良好。

圖8 線性范圍標準曲線圖

1.4.3 精密度考察

艾葉供試品精密度考察的平均吸光度值為0.339(n=6)，RSD=0.15%，表明本實驗儀器精密度非常好。

1.4.4 重復性考察

艾葉供試品重復性考察的平均吸光度值為0.345(n=6)，RSD=1.66%，可知該方法重復性良好。

1.4.5 加樣回收試驗

平行移取6份0.5 mL艾葉供試品試液，分別精密加入葡萄糖標準品試液0.1 mL并按“1.3.3”項下最適苯酚-濃硫酸法進行處理，可得平均吸光度值為0.347(n=6)，加樣回收率平均值為97.63%，RSD=1.67%，故表明本方法的加樣回收率較好。

1.4.6 穩(wěn)定性考察

分別于1 h、2 h、4 h、8 h、24 h后對新配制的艾葉供試品試液按“1.3.3”項下最適苯酚-濃硫酸法進行顯色處理并測定吸光度A值，計算可得穩(wěn)定性考察的平均吸光度值為0.352(n=6)，RSD=1.43%，表明艾葉供試品試液在24 h內比較穩(wěn)定。

2 結 論

苯酚-濃硫酸法是多糖含量測定中的普遍使用的顯色方法。其原理為：在濃硫酸的作用下，多糖可以水解變?yōu)閱翁?，后者能夠迅速脫水，形成糠醛衍生物，生成的糠醛衍生物可與苯酚發(fā)生顯色反應，從而形成橙黃色化合物[12]。該物質顏色穩(wěn)定，且一定濃度范圍內，多糖含量(濃度)與吸光度值成線性正比，可用比色法測定。

根據對苯酚-濃硫酸法最適反應條件考察可知：①為保證苯酚-濃硫酸法處理多糖時的顯色產物穩(wěn)定，應在30 min至4 h內利用紫外分光光度計進行測定；②具塞比色管體積應超過反應溶液總體積兩倍以上，以避免由于液體混合不勻所造成的誤差；③操作中的每一步均應該充分振蕩，控制操作手法盡量一致；④在加入濃硫酸后，應該在室溫下靜置10 min，后再于水浴鍋中加熱。

根據紫外分光光度法對艾葉多糖含量測定系統方法學考察可知：以純凈水為空白，以葡萄糖標準品為對照且取樣量為0.2 mL，艾葉供試品取樣量為1 mL，采用上述苯酚-濃硫酸法最佳顯色條件處理試液，在波長487 nm處，用紫外分光光度計測定艾葉多糖含量。本方法專屬性強，簡單易操作，重復性較好，穩(wěn)定可靠，可滿足對艾葉多糖含量測定的要求。