袁東亮，權(quán)偉，陳奕晨，龔陽(yáng)澤，劉凌之，邵青，翟媛媛，趙正杭

1 西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，西安 710061；2 空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科；3 西安市精神衛(wèi)生中心藥劑科

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，由于血腦屏障的存在，中樞神經(jīng)系統(tǒng)通常被視為“免疫豁免區(qū)”；但近年研究顯示，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也可出現(xiàn)炎癥介質(zhì)水平增高［1］。神經(jīng)炎癥假說在抑郁癥病理機(jī)制中具有重要作用［2］。有研究表明，通過基因芯片篩選抑郁癥小鼠海馬組織中差異表達(dá)的炎癥因子基因，發(fā)現(xiàn)CXC 趨化因子配體5（CXCL5）表達(dá)差異最為明顯。趨化因子是一類小分子堿性蛋白，主要功能是趨化細(xì)胞定向移動(dòng)。CXCL5 為趨化因子CXC 家族成員，主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞，也可表達(dá)于嗜酸性粒細(xì)胞。中性粒細(xì)胞是先天性免疫監(jiān)視的重要組成部分，同時(shí)在炎癥導(dǎo)致的病理?yè)p傷中發(fā)揮重要作用［3］。研究顯示，CXCL5 信號(hào)通路與神經(jīng)炎癥及血腦屏障損傷相關(guān)，并可導(dǎo)致腦白質(zhì)損傷［4］。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CXCL5 與創(chuàng)傷性腦損傷、人腦內(nèi)皮屏障破壞等相關(guān)［5］。CXCL5與抑郁癥的關(guān)系及其相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證。2021 年6 月—2022 年1 月，我們通過繁殖CXCL5 基因敲除小鼠，并進(jìn)一步構(gòu)建抑郁癥模型，觀察其行為學(xué)及血清炎癥因子水平，初步探討CXCL5在抑郁癥發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生CXCL5＋/－雜合子小鼠4只，5～6 周齡，雌雄各半，體質(zhì)量（18±2）g，購(gòu)自廣州賽業(yè)生物科技有限公司。小鼠飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，室內(nèi)溫度20～25 ℃，濕度50%～60%。每周換2 次墊料，隔天添加食物和水。新生C57野生型小鼠16只，4周齡，雌雄各半，體質(zhì)量（18±2）g，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑與儀器 TreliefTMMouse Direct PCR Kit（Genotyping）試劑購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司；DL1000 bp DNA Maker 購(gòu)自寶生物（大連）有限公司；瓊脂糖粉購(gòu)自德國(guó)Sigma 公司；引物由北京擎科生物科技有限公司合成。Mini-Sub cell G 電泳儀及凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；PCR儀器購(gòu)自Applied Biosystems 公司；低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Hettich 公司。TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 CXCL5＋/－雜合子小鼠的繁殖 取飼養(yǎng)12周達(dá)到性成熟的CXCL5＋/－雜合子小鼠，雌雄配對(duì)分為兩籠進(jìn)行繁殖。取繁殖后的子代小鼠行基因型鑒定。

1.3 子代小鼠基因型的鑒定 取出生4 周的子代小鼠，剪取小塊鼠尾，采用qRT-PCR 法進(jìn)行基因型鑒定。提取組織DNA，使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 的質(zhì)量濃度和純度。按照TreliefTMMouse Direct PCR Kit（for Genotyping）試 劑盒操作說明進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列：CXCL5 敲除型上游 5＇-AAGACGACGGACGTGGGGTT-3＇，下 游 5＇-GGAGGGAAAGCCTATTTGGC-3＇，條帶長(zhǎng)度856 bp；CXCL5 野 生 型 上 游5＇-CATGTTTGAATATGGATTGCTGAG-3＇，下游5＇-GGAGGGAAAGCCTATTTGGC-3＇，條帶長(zhǎng)度711 bp。擴(kuò)增體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，無酶水9.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA 模板1 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，加入1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓60～100 V，電泳30 min 后取出，凝膠成像儀觀察結(jié)果。純合子（CXCL5＋/＋）基因型的擴(kuò)增產(chǎn)物為711 bp，純合子（CXCL5－/－）基因型的擴(kuò)增產(chǎn)物為856 bp，均在凝膠成像顯示為一個(gè)條帶。雜合子（CXCL5＋/－）基因型的產(chǎn)物為711 bp 及856 bp，在凝膠成像顯示為兩個(gè)條帶。

1.4 CXCL5－/－小鼠的篩選 雌雄雙雜合子交配，其子代可能出現(xiàn)純合子CXCL5＋/＋、雜合子CXCL5＋/－和純合子CXCL5－/－3 種基因型。鑒定為CXCL5－/－的子代小鼠用于繼續(xù)繁殖，CXCL5＋/＋及CXCL5＋/－小鼠不是實(shí)驗(yàn)所需，全部處死。因抑郁癥小鼠在造模過程中可能發(fā)生死亡，為了保證足夠數(shù)量進(jìn)行體質(zhì)量監(jiān)測(cè)和行為學(xué)評(píng)估、血清檢測(cè)，故待CXCL5－/－小鼠繁殖至30 只再開始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。最終獲得16只雌性、14只雄性CXCL5－/－小鼠。

1.5 小鼠體質(zhì)量檢測(cè) 取CXCL5－/－小鼠和C57 野生型小鼠各8只，雌雄各半，記錄小鼠4、6、8、10周齡時(shí)的體質(zhì)量。

1.6 小鼠抑郁癥模型的建立 由于雌鼠性激素水平波動(dòng)明顯，抑郁模型不穩(wěn)定，故只取雄鼠建立抑郁癥模型。取10 周齡雄性CXCL5－/－小鼠和雄性C57野生型小鼠，以慢性不可預(yù)見性的溫和刺激（CUMS）配合孤養(yǎng)建立抑郁癥模型［6］。小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，1 只/籠。CUMS 刺激因素：①45℃熱刺激5 min；②夾尾5 min；③6 ℃冷水游泳5 min；④搖晃5 min；⑤夜間強(qiáng)光照射5 min；⑥禁食24 h；⑦禁水24 h。在28 d 內(nèi)每天隨機(jī)給予上述1 種刺激，使小鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生，以避免產(chǎn)生適應(yīng)，每種刺激實(shí)施4次。以小鼠出現(xiàn)自主活動(dòng)明顯減少為造模成功。

1.7 小鼠抑郁癥的行為學(xué)評(píng)估 取小鼠進(jìn)行抑郁癥行為學(xué)評(píng)估。①?gòu)?qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（FST）：將小鼠放進(jìn)盛水的透明玻璃杯中，水溫（22 ± 1）℃，水深12 cm。實(shí)驗(yàn)持續(xù)6 min，使用高清數(shù)碼攝像機(jī)記錄小鼠的活動(dòng)，采用雙盲法統(tǒng)計(jì)后4 min內(nèi)小鼠在水中一動(dòng)不動(dòng)的時(shí)間。②懸尾實(shí)驗(yàn)（TST）：將小鼠尾巴用膠帶固定懸掛起來，固定位置在距離尾尖約1 cm處，小鼠頭距離放置固定平臺(tái)的桌面約10 cm。實(shí)驗(yàn)持續(xù)6 min，使用高清數(shù)碼攝像機(jī)記錄小鼠的活動(dòng)，采用雙盲法統(tǒng)計(jì)小鼠在6 min內(nèi)不動(dòng)的總時(shí)間。1.8 小鼠血清炎癥因子檢測(cè) 行為學(xué)評(píng)估結(jié)束后，小鼠腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30 min，4 ℃下4500 r/min 離心5 min，分離血清。按照ELISA 試劑盒說明書方法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以-x±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCL5－/－小鼠與野生型小鼠的體質(zhì)量比較雄性及雌性CXCL5－/－純合子小鼠在4、6、8、10 周齡時(shí)的體質(zhì)量與同周齡、同性別野生型小鼠比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 CXCL5－/－小鼠與野生型小鼠4、6、8、10周齡的體質(zhì)量比較（g，±s）

表1 CXCL5－/－小鼠與野生型小鼠4、6、8、10周齡的體質(zhì)量比較（g，±s）

組別CXCL5－/－小鼠雌性雄性野生型小鼠雌性雄性n 8 4 4 8 4 4體質(zhì)量第4周10.12±0.6512.08±0.9711.22±0.7312.56±1.24第6周17.78±0.8719.25±0.6618.21±0.6520.23±1.46第8周19.73±0.4522.45±1.5420.21±0.9823.72±1.13第10周20.72±1.5323.68±1.6021.13±1.5224.43±1.41

2.2 CXCL5－/－與野生型抑郁癥小鼠行為學(xué)比較CXCL5－/－抑郁癥小鼠的TST、FST 實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間均較野生型抑郁癥小鼠縮短（P均＜0.05）。見表2。

表2 CXCL5－/－與野生型抑郁癥小鼠抑郁癥行為學(xué)比較（min，±s）

表2 CXCL5－/－與野生型抑郁癥小鼠抑郁癥行為學(xué)比較（min，±s）

注：與野生型比較，*P＜0.05。

組別CXCL5－/－小鼠野生型小鼠n 8 8 TST實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間1.64±0.36*2.14±0.41 FST實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間0.71±0.21*1.50±0.23

2.3 CXCL5－/－與野生型抑郁癥小鼠血清炎癥因子水平比較 CXCL5－/－抑郁癥小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均較野生型抑郁癥小鼠降低（P均＜0.05）。見表3。

表3 CXCL5－/－與野生型抑郁癥小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（pg/mL，±s）

表3 CXCL5－/－與野生型抑郁癥小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（pg/mL，±s）

注：與野生型比較，*P＜0.05。

組別CXCL5－/－小鼠野生型小鼠n 8 8 TNF-α 427.4±124.1*566.4±127.5 IL-1β 85.8± 9.1*121.9±20.4 IL-6116.9±11.4*149.4±17.0

3 討論

抑郁癥是一種常見且容易復(fù)發(fā)的精神疾病，其病因復(fù)雜，主要由遺傳、代謝和社會(huì)因素等多方面因素影響，具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確。其中免疫介導(dǎo)的抑郁癥機(jī)制深受研究者的關(guān)注，以往對(duì)精神疾病的免疫機(jī)制研究主要集中在促炎細(xì)胞因子方面，大量臨床實(shí)驗(yàn)研究顯示抑郁癥與中樞和外周血中促炎癥因子的增加有關(guān)，外周血中炎癥因子可通過特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨過血腦屏障的方式在腦中擴(kuò)散，激活或參與腦部炎癥反應(yīng)，最終影響腦部情緒調(diào)節(jié)區(qū)域的神經(jīng)元活動(dòng)和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，進(jìn)而引發(fā)抑郁癥狀［7］。先前的研究忽略了其他免疫蛋白，如趨化因子。目前研究表明，趨化因子在多種精神疾病如抑郁癥［8］的發(fā)生過程中起重要作用，這一作用已超出其經(jīng)典趨化作用，主要包括神經(jīng)調(diào)節(jié)作用，神經(jīng)遞質(zhì)樣作用，直接或間接神經(jīng)生成調(diào)節(jié)作用［9］。相關(guān)的趨化因子包括CXC 趨化因子配體8、CC 趨化因子配體（CCL）2、CCL3、CCL5。這些蛋白可能成為未來診斷及治療抑郁癥新的標(biāo)志物或治療新靶點(diǎn)。

我們的前期研究采用炎癥細(xì)胞因子與受體PCR芯片，檢測(cè)了84個(gè)炎癥細(xì)胞因子基因在應(yīng)激性抑郁癥小鼠腦區(qū)差異表達(dá)情況，篩選出趨化因子CXCL5［3］；認(rèn)為該基因可能成為未來診斷及治療抑郁癥新的標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。但是CXCL5參與抑郁癥發(fā)生的機(jī)制仍不十分清楚。因此，CXCL5基因敲除小鼠可為進(jìn)一步研究該基因與抑郁癥的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

我們使用4只CXCL5＋/－雜合子小鼠進(jìn)行繁殖獲得CXCL5－/－純合子小鼠，并采用PCR法鑒定了子代的基因型。經(jīng)鑒定為的純合子的雌雄小鼠，進(jìn)一步繁殖備用，并對(duì)基因敲除型及野生型小鼠的體質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。這是因?yàn)樵摶蚯贸∈鬄橥耆蚯贸夹g(shù)，通過體質(zhì)量監(jiān)測(cè)初步來評(píng)估基因敲除對(duì)小鼠的健康生長(zhǎng)是否有較大影響。通過研究發(fā)現(xiàn)兩組體質(zhì)量無顯著差異，證明該基因的敲除對(duì)小鼠的健康影響不大，可進(jìn)行下一步抑郁樣行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

CUMS 模擬了部分應(yīng)激原，外部環(huán)境刺激，經(jīng)過4 周的應(yīng)激刺激會(huì)使動(dòng)物機(jī)體的功能障礙，導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生。CUMS 造模后動(dòng)物出現(xiàn)體運(yùn)動(dòng)能力降低，快感缺乏及血漿皮質(zhì)激素升高等均與人類抑郁癥狀相似，能較真實(shí)地模擬抑郁癥病人的某些病因和癥狀，因此是比較理想可靠的抑郁動(dòng)物模型［10］。FST 實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)抑郁樣行為的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法，通過直接觀察小鼠強(qiáng)迫游泳6 min內(nèi)后4 min的不動(dòng)時(shí)間來判斷抗抑郁反應(yīng)。不動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)，抑郁作用越強(qiáng)。TST 實(shí)驗(yàn)是一種經(jīng)典而又能快速評(píng)價(jià)抑郁的方法。其原理是利用小鼠懸尾后企圖逃脫但又無法逃脫，從而放棄掙扎，進(jìn)入特有的抑郁不動(dòng)狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)過程中記錄動(dòng)物不動(dòng)時(shí)間來反映抑郁狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，CXCL5－/－小鼠和野生型小鼠在應(yīng)激性抑郁狀態(tài)下的行為學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)CXCL5－/－小鼠的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間及懸尾不動(dòng)時(shí)間均顯著縮短，證明該基因可能與小鼠抑郁樣行為有關(guān)；提示CXCL5 的敲除阻斷了應(yīng)激引起的小鼠抑郁樣行為。

IL-1β是IL-1家族中的重要成員，由于其在炎癥相關(guān)疾病中的重要作用而備受關(guān)注。IL-1β 具有較強(qiáng)的促炎活性，可誘導(dǎo)多種促炎介質(zhì)，如細(xì)胞因子和趨化因子［11］。與IL-1β相似，TNF-α是一種多效性促炎細(xì)胞因子，屬于TNF 配體超家族。TNF-α 在調(diào)節(jié)多種發(fā)育和免疫過程中發(fā)揮不同的作用，包括炎癥、分化、脂質(zhì)代謝和凋亡等，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［12-13］。IL-1β 的局部激活是介導(dǎo)促炎反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，導(dǎo)致繼發(fā)性炎癥介質(zhì)（包括IL-6）的激活［14］。有研究顯示，TNF-α、IL-1β、IL-6 等在腦梗死后抑郁癥患者的血清中升高，而抗抑郁藥物能降低以上炎性因子［15-16］。本研究結(jié)果顯示，野生型抑郁癥小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等均升高，而CXCL5－/－抑郁癥小鼠血清炎癥因子水平降低，說明敲除CXCL5 能夠減輕抑郁小鼠血清炎癥因子水平，提示敲除CXCL5 可能在一定程度上減輕抑郁造成的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。綜上所述，本研究采用CXCL5＋/－雜合子小鼠成功繁殖獲得CXCL5－/－純合子小鼠；CXCL5的敲除阻斷了應(yīng)激引起的小鼠抑郁樣行為，并在一定程度上減輕了抑郁造成的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這將為CXCL5與抑郁癥發(fā)病機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。