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        微生物組技術(shù)分析犬子宮蓄膿宮內(nèi)菌群特征

        2022-05-20 09:41:12張玉珠鄭慧華劉祥雨楊濘毓杜崇濤謝光洪
        關(guān)鍵詞:蓄膿膿液菌門

        張玉珠,鄭慧華,劉祥雨,2,楊濘毓,2,杜崇濤*,謝光洪*

        (1.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130062;2.謝博士動(dòng)物醫(yī)院,吉林 長春 130062)

        作為臨床上的常見疾病,犬子宮蓄膿是指犬子宮腔內(nèi)有大量的膿液并伴有子宮內(nèi)膜炎和子宮內(nèi)膜異常增生,是未絕育母犬常見的子宮疾?。?]。子宮蓄膿是一種潛在的威脅生命的疾病,若治療不及時(shí),可能會有致命的后果。臨床上對犬子宮蓄膿最常見的治療方法是卵巢子宮切除術(shù)。盡管該方法可降低患犬的死亡率,但有研究表明絕育(即卵巢子宮切除)對犬的健康存在潛在威脅,甚至激發(fā)某些疾病,如癌癥[2-3]、骨科疾?。?-5]和肥胖[6]等。犬子宮蓄膿可能是機(jī)體內(nèi)激素和細(xì)菌共同作用造成的[7],但迄今為止,其發(fā)病機(jī)制和規(guī)律尚不清晰。

        在人類生殖道系統(tǒng)的研究中,子宮作為重要的生殖器官,臨床上伴發(fā)各種疾病如慢性子宮內(nèi)膜炎,子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜癌等,嚴(yán)重影響女性的生殖和身心健康。隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn),發(fā)現(xiàn)子宮類疾病發(fā)生時(shí),其子宮內(nèi)部存在豐富的微生物組,如子宮內(nèi)膜炎患者的子宮內(nèi)主要菌群有酸桿菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門[8]。而與人類生活息息相關(guān)的伴侶動(dòng)物犬在子宮蓄膿時(shí)是否有子宮內(nèi)菌群的參與,這一研究在國際上是空白的。因此,本研究首次通過16S rRNA 測序技術(shù)分析犬子宮蓄膿病例的子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織的菌群特征,為該病的預(yù)防和治療提供了微生物學(xué)新思路。

        1 材料與方法

        1.1 樣本的采集

        19 份子宮膿液和9 份子宮內(nèi)膜均來自長春市謝博士動(dòng)物醫(yī)院的確診病例,通過卵巢子宮切除術(shù)將切除的組織立馬在無菌操作臺,將子宮表面用碘伏擦拭干凈,用手術(shù)刀片切開子宮,在相同位置取適量的膿液放于1.5 mL 無菌Ep 管中,編碼為PB001-PB011,PBB001-PBB008,即為PB 組;用無菌手術(shù)刀在采取膿液的相同位置刮取適量子宮內(nèi)膜組織放于1.5 mL 無菌Ep 管中,編碼為PP001-PP009,即為PP 組;并迅速放入-80℃冰箱保存。

        1.2 總DNA 提取與檢測

        采用TIANGEN 試劑盒對犬子宮蓄膿病例的子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織樣本提取細(xì)菌總DNA,具體的操作步驟嚴(yán)格按照TIANGEN 試劑盒說明書,之后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測了DNA的濃度和純度。

        1.3 PCR 擴(kuò)增與高通量測序

        樣本DNA 通過檢測合格之后,用無菌用水將適量DNA 樣本稀釋至1 μg·μL-1并放置于離心管中,作為擴(kuò)增模板。以515F 和806R為引物選取細(xì)菌16S rDNA V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增:(熱循環(huán)包括98 ℃預(yù)變性1 min;30個(gè)循環(huán)(98 ℃變性10 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s);72 ℃終延伸5 min),然后在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。將PCR 產(chǎn)物以等密度比例進(jìn)行混合,然后用Qiagen 凝膠提取試劑盒(Qiagen,Germany)進(jìn)行純化,混合PCR 產(chǎn)物。使用建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)檢驗(yàn)合格之后,使用NovaSeq PE250 進(jìn)行上機(jī)測序,以上均由諾禾致源生物科技有限公司完成。

        1.5 數(shù)據(jù)分析

        對測序所得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾后,會得到有效數(shù)據(jù),從而使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確和可靠。然后在有效數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTUs),使用Qiime 軟件(Version 1.9.1)計(jì) 算Shannon、Simpson、Chao 1、ACE、Coverage 數(shù)據(jù)進(jìn)行Alpha 多樣性指數(shù)分析樣本犬子宮蓄膿子宮內(nèi)膿汁菌群和子宮內(nèi)膜菌群的豐富度和多樣性。使用Beta 多樣性來分析不同樣本間的差異程度。用LEfSe 分析尋找兩組間顯著差異性物種。

        1.6 統(tǒng)計(jì)分析

        使用SPSS18.0 軟件統(tǒng)計(jì)和分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 犬子宮蓄膿宮內(nèi)菌群OTUs 分析

        為研究犬子宮蓄膿子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織菌群情況,通過16S rRNA 基因測序方法對19例患犬的子宮內(nèi)膿液(PB 組)和9 例患犬子宮內(nèi)膜組織(PP 組)的細(xì)菌進(jìn)行測序,從而比較分析兩者菌群特征。PB 組和PP 組共有28 份樣本,經(jīng)Illumina NovaSeq 測序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和質(zhì)控,得到2 243 247 條優(yōu)化序列,再進(jìn)行嵌合體過濾,得到1 697 886 條有效數(shù)據(jù)。為了研究各樣本的物種組成,以97%的一致性進(jìn)行了OTUs 聚類分析(圖1),發(fā)現(xiàn)PB 組OTU 數(shù)量有5738個(gè),PP 組OTU 數(shù)量有3788個(gè),2 組一共有7741個(gè)OTU 數(shù)量,其中1785個(gè)OTUs 是2 組共有的,PB 組特有的OTU 數(shù) 量為3953個(gè),PP 組 特 有 的OTU 數(shù) 量為2003個(gè)。

        圖1 PB 組和PP 組組間韋恩圖Fig.1 Venn diagram in different groups

        2.2 犬子宮蓄膿宮內(nèi)菌群Alpha 多樣性比較

        PB 組和PP 組2 組樣本在97%一致性閾值下的Alpha Diversity 多樣性分析表明,指數(shù)Shannon、Simpson、Chao1、Ace 在2 組之間均無顯著性差異(P>0.05),指數(shù)Coverage(即樣本菌群覆蓋率)均大于99%,說明樣本中沒有被測出來的概率極低。稀釋曲線(A)的繪制,可以直觀反應(yīng)測序樣本數(shù)量的合理性(圖2)。Rank Abundance 曲線(B)的繪制,直觀反應(yīng)了樣本中物種的豐富度和均勻度。2者表明,本試驗(yàn)測序取樣數(shù)量合理。

        圖2 犬的子宮蓄膿樣本稀釋曲線(A)和等級聚類曲線(B)Fig.2 Rarefaction Curve(A)and Rank Abundance(B)of canine pyometra samples

        2.3 犬子宮蓄膿宮內(nèi)菌群的物種相對豐富度

        根據(jù)物種注釋結(jié)果,選取PB 組19 份樣本和PP 組9 份樣本(圖3A)以及PB 組和PP 組(圖3B)在門水平上細(xì)菌豐富度排名前10 的物種,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PB 組優(yōu)勢物種有變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteriota)和脫硫菌門(Desulfobac?terota),豐富度依次為0.611、0.229、0.042、0.010和0.003;PP 組優(yōu)勢物種有變形菌門(Proteobacte?ria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroide?tes)、脫 硫 菌 門(Desulfobacterota)和A放 線 菌 門(ctinobacteriota),豐 富 度 依次為0.696、0.074、0.026、0.014 和0.012。其 中,PB 組 變 形 菌 門(Proteobacteria)顯著低于PP 組,而厚壁菌門(Fir?micutes)顯著高于PP 組(P<0.05)。

        圖3 PB 組和PP 組在門水平上相對豐度比較Fig.3 Comparison of phylum horizontal relative abundance of PB group and PP group

        2.4 犬子宮蓄膿宮內(nèi)菌群Beta 多樣性比較

        主 坐 標(biāo) 分 析(principal co-ordinate analysis,PCoA)是在空間中,不同組樣本間在二維平面上呈現(xiàn)出來的相似的距離。而樣本間的距離是通過在二維平面坐標(biāo)軸上所進(jìn)行的不同角度的投影,從而找出最可以反應(yīng)出原始距離分布的前2個(gè)坐標(biāo)軸的值,常用于微生物的Beta 多樣性分析。結(jié)果表明,如果在二維平面上兩組樣本的距離越接近,表明兩組樣本的物種組成結(jié)構(gòu)是越相似的,因此群落結(jié)構(gòu)相似度高的各樣本就會在二維平面上傾向于聚集在一起,而群落差異很大的各樣本就會遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開。由圖4可知,PB 組與PP 組樣本菌群群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異。

        2.5 犬子宮蓄膿宮內(nèi)菌群LDA 差異貢獻(xiàn)分析

        LDA Effect Size 分析是一種用于發(fā)現(xiàn)和解釋高緯度數(shù)據(jù)生物標(biāo)識的分析工具。LDA 值分布柱狀圖中展示了LDA Score(線性判別分析影響值)大于4 的顯著差異物種,如圖5A所示,LDA Score大于4 的biomarker 共有30個(gè),包括:脫硫菌屬(De?sulfuromonadia)、志賀氏桿菌屬(Escherichia_Shi?gella)、大腸埃希菌屬(Escherichia_coli)、潘多拉菌屬(Pandoraea)、支原體目(Mycoplasmatales)、支原體科(Mycoplasmataceae)、綠膿桿菌屬(Pseudo?monas_aeruginosa)、嗜 血 桿 菌 屬(Haemophilus)等。進(jìn)化分支圖圓圈由內(nèi)向外代表了由門至屬的分類級別,小圓圈的直徑大小代表了相對豐富度,紅色節(jié)點(diǎn)表示犬子宮蓄膿宮內(nèi)膿汁組中起到重要作用的微生物,主要有支原體科(Mycoplasmatace?ae)、支 原 體 目(Mycoplasmatales)、希 萬 氏 菌 科(Shewanellaceae)、交替單胞菌目(Alteromonad?ales),綠色節(jié)點(diǎn)表示犬子宮蓄膿子宮內(nèi)膜組中起重要作用的微生物,黃色節(jié)點(diǎn)表示無顯著差異的物種。

        圖5 PB 組與PP 組LDA 值分布柱狀圖(A)和進(jìn)化分布圖(B)Fig.5 LDA bar(A)and evolutionary(B)of PB group and PP group

        3 討論

        近幾十年,與伴侶動(dòng)物犬繁殖有關(guān)的子宮類疾病逐漸增多,這給犬的健康造成了嚴(yán)重的威脅,同時(shí)給飼養(yǎng)犬的寵主帶來了極大的身心和經(jīng)濟(jì)損失[9]。母犬是最容易診斷出嚴(yán)重的子宮病理變化的物種,而且診斷的患病率明顯更高,這表明可能存在一些特定的機(jī)制可以導(dǎo)致犬的子宮內(nèi)膜功能紊亂[9]。犬子宮蓄膿常發(fā)生于中老年母犬[9-10],但更年輕化的犬中也偶有發(fā)生[11]。激素和細(xì)菌因素對子宮蓄膿的發(fā)展起著重要作用。大腸桿菌是犬子宮蓄膿中最易分離出來的細(xì)菌,主要粘附在孕激素刺激的子宮內(nèi)膜受體上,可導(dǎo)致感染[12]。目前,盡管學(xué)者對犬子宮蓄膿進(jìn)行了廣泛研究,但該疾病的發(fā)病機(jī)制仍是不清楚的。

        子宮作為哺乳動(dòng)物的生殖器官,臨床上伴發(fā)各種疾病如慢性子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜癌等,且患者的子宮內(nèi)存在豐富的微生物組。目前關(guān)于犬生殖道微生物群的信息很少,所有可用的數(shù)據(jù)都是通過培養(yǎng)技術(shù)獲得的。有研究已證實(shí),標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)技術(shù)未能檢測到90%的優(yōu)勢菌群,低估了多樣性[13]。迄今,16S rRNA 高通量測序技術(shù)已被廣泛用于腸道[14]、口腔[15]、乳房[16]、胰腺[17]、陰道[18]病變部位等的菌群組成結(jié)構(gòu)研究。而子宮中的微生物群在化膿性子宮發(fā)育中的作用是怎么樣的,可以用新的測序方法進(jìn)行更詳細(xì)的研究。在以往的研究中,對人的子宮內(nèi)菌群研究較少,有關(guān)犬子宮蓄膿的子宮內(nèi)菌群的特征分析在尚未報(bào)道。本研究通過16S rRNA 基因測序技術(shù)對犬子宮蓄膿的子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織的菌群進(jìn)行對比分析,發(fā)現(xiàn)患犬的子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織均存在菌群且無明顯差異,在門水平上主要是變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteriota)和脫硫菌門(Desulfobacterota);發(fā)現(xiàn)患犬子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織的Alpha 多樣性無明顯差別(P>0.05)。但通過Beta 多樣性分析發(fā)現(xiàn)兩組樣本的菌群群落結(jié)構(gòu)存在差異。其中,患犬子宮內(nèi)膿液中的變形菌門(Proteobacte?ria)豐富度明顯低于子宮內(nèi)膜組織,而厚壁菌門(Firmicutes)明顯高于子宮內(nèi)膜組織,另外放線菌門(Actinobacteriota)和 脫 硫 菌 門(Desulfobacte?rota)在2 者內(nèi)的豐富度也存在差異。為進(jìn)一步篩選出2 組間顯著差異的特異性細(xì)菌,進(jìn)行了LDA差異貢獻(xiàn)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 組有30個(gè)物種存在顯著性差異,其中患犬子宮內(nèi)膿液中的志賀氏桿菌屬(Escherichia_Shigella)、大腸埃希菌屬(Esche?richia_coli)顯著高于患犬子宮內(nèi)膜組織,而綠膿桿菌 屬(Pseudomonas_aeruginosa)、嗜 血 桿 菌 屬(Haemophilus)顯著低于患犬子宮內(nèi)膜組織。因此,本研究通過對犬子宮蓄膿子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織菌群的對比分析,以期為小動(dòng)物臨床子宮疾病微生物學(xué)防治提供參考。

        4 結(jié)論

        本研究發(fā)現(xiàn)子宮蓄膿患犬的子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織均存在特異的微生物菌群和差異性物種,為小動(dòng)物臨床子宮疾病的微生物學(xué)防治提供了新思路,而目前犬子宮蓄膿的發(fā)病機(jī)理尚不清晰,還需進(jìn)一步的研究。

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