王 宇 張 鍇 王艷麗 司增志 王冰冰 喬亞科,*

(1 河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院，河北 秦皇島 066000； 2 河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，河北 秦皇島 066000)

草甘膦(N-膦酰甲基甘氨酸)是目前大豆生產(chǎn)上廣泛使用的除草劑。草甘膦在植株體內(nèi)作用靶標為5-稀醇式丙酮-莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)，通過競爭磷酸稀醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，抑制植株體內(nèi)EPSPS酶活性，導(dǎo)致植株體內(nèi)莽草酸大量積累，抑制芳香族氨基酸(即苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)的生物合成，最終導(dǎo)致植株死亡[1]。由于栽培大豆(Glycinemax)草甘膦耐性較差，大豆生產(chǎn)迫切需求耐草甘膦新品種。野生大豆(Glycinesoja)是栽培大豆的近緣野生種，僅天然存在于中國、日本、韓國等少數(shù)國家，是栽培大豆寶貴的種質(zhì)資源。野生大豆存在耐干旱[2]、耐鹽堿[3-5]的優(yōu)異種質(zhì)資源，且與栽培大豆無生殖隔離，是栽培大豆優(yōu)異耐性基因的來源。

在耐草甘膦野生大豆種質(zhì)篩選方面，高越等[6]對67份野生大豆的耐草甘膦進行鑒定，發(fā)現(xiàn)不同野生大豆材料間的草甘膦耐性差異很大，通過田間噴施鑒定篩選到高耐草甘膦野生大豆材料ZYD0685和ZYD2405。王迪[7]對425份野生大豆進行耐草甘膦鑒定，篩選到2011-32等26份抗性較好的野生大豆種質(zhì)。說明野生大豆中存在草甘膦耐性優(yōu)異的種質(zhì)資源，可作為親本材料與栽培大豆配制雜交組合，創(chuàng)制耐草甘膦栽培大豆新品種。

草甘膦處理能夠顯著影響栽培大豆生理生化過程。Reddy等[8]研究發(fā)現(xiàn)，1.12 kg a.i·hm-2濃度的草甘膦噴施可顯著降低敏感大豆材料的葉綠素含量，但對耐性大豆材料的葉綠素含量無顯著影響，Krenchinski等[9]和Zobiole等[10-11]也報道了類似結(jié)果。原向陽等[12]研究了缺磷脅迫條件下噴施草甘膦對抗草甘膦大豆材料的影響，發(fā)現(xiàn)缺磷脅迫和噴施草甘膦顯著降低了抗草甘膦大豆的光合速率，說明噴施草甘膦對植株的光合作用影響較大。此外，草甘膦噴施與大豆地上部和根系生物量以及根瘤生物量和數(shù)量的減少有關(guān)[13-15]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦處理除影響植株光合作用外，還會引發(fā)植株體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量升高和抗氧化防御系統(tǒng)失活，進一步引發(fā)脂質(zhì)過氧化，這可能是引發(fā)植株細胞死亡的原因[16-17]。

種植耐草甘膦大豆品種并噴施草甘膦是解決大豆種植中雜草問題的關(guān)鍵。目前，耐草甘膦作物主要通過兩種策略獲得：過表達或沉默植株EPSPS基因[18-19]，但該方法可能導(dǎo)致草甘膦在植物組織中積累，對作物產(chǎn)量造成影響[20]；過表達草甘膦氧化還原酶(glyphosate oxidoreductase，GOX)基因或草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(glyphosate N-acetyltransferase，GAT)基因。GOX基因能夠降解草甘膦為乙醛酸和氨基甲基膦酸，使草甘膦對作物的毒害降低，而GAT通過催化草甘膦的乙?；饔茫到獠莞熟埢鵞21-22]。在大豆耐草甘膦品種培育方面，目前應(yīng)用較多的是過表達CP4-EPSPS基因，該基因來源于土壤細菌Agrobacteriumsp.菌株CP4，由于其與草甘膦的親和力較低，過表達該基因的轉(zhuǎn)基因植物具有正常EPSPS基因功能，表現(xiàn)出對草甘膦較強的耐受性[23]。除此之外，也有其他抗草甘膦基因應(yīng)用于大豆育種的研究[24-25]，但是由于這些大豆品種均需通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得，目前無法在我國種植，因此篩選耐草甘膦野生大豆種質(zhì)并將其耐性基因通過雜交手段轉(zhuǎn)入栽培大豆中是解決我國大豆生產(chǎn)上面臨難題的有效途徑。

本試驗對采集于河北省的862份野生大豆材料進行耐草甘膦鑒定，對篩選的高耐和高敏野生大豆材料噴施草甘膦后的莽草酸含量、脂質(zhì)過氧化水平(MDA含量)、葉綠素含量、抗氧化酶活性及EPSPS基因表達等與草甘膦耐受性相關(guān)的指標進行測定，旨在篩選高耐除草劑野生大豆種質(zhì)并初步解析其耐性機制。

1 材料與方法

1.1 試材種植及草甘膦耐性鑒定

862份野生大豆材料由河北科技師范學(xué)院野生大豆課題組提供。由于野生大豆種子外覆蓋一層泥漿膜，在播種前需要用小刀破皮。把破皮的野生大豆種子種植于50孔育苗盤內(nèi)，每個材料播3孔，每孔播5粒種子。育苗盤置溫室中培育發(fā)芽，至V2生長階段，即第二對復(fù)葉完全展開時，噴施濃度為1.125 kg a.i·hm-2、 有效成分含量為41%草甘膦異丙胺鹽水劑(孟山都，美國)處理液。用手持噴霧器對植株葉片進行均勻噴霧。7 d后觀察記錄植株受害癥狀，按表1標準劃分耐性等級：

表1 野生大豆耐草甘膦鑒定耐性等級分級標準Table 1 Classification standard for glyphosate tolerance grade of wild soybean

1.2 生理指標測定

將篩選到的高耐和高敏野生大豆材料在營養(yǎng)缽中種植。V2期噴施濃度為1.125 kg a.i·hm-2的草甘膦溶液，以噴施清水為對照，0、3、10、24、48 h后取樣測定。丙二醛(malondialdehyde, MDA)和葉綠素含量測定參照王鵬等[26]的方法，莽草酸含量測定參照原向陽等[27]的方法，過氧化物酶(peroxidase，POD)活性利用A084-3-1過氧化物酶測定試劑盒進行測定(南京建成生物工程研究所)，過氧化氫酶(catalase，CAT)活性利用A007-1-1過氧化氫酶測定試劑盒進行測定(南京建成生物工程研究所)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性利用A001-3-2總超氧化物歧化酶測定試劑盒進行測定(南京建成生物工程研究所)。上述試驗均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 草甘膦相關(guān)基因表達測定

高耐和高敏野生大豆材料種植及取樣方法同1.2。取野生大豆材料植株葉片提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板，β-Tubulin為內(nèi)參基因進行草甘膦耐性相關(guān)基因EPSPS表達量的測定。通過GenBank獲得基因全長并利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)引物，其中EPSPS基因qRT-PCR檢測所用引物為F：TGCTTTCTTGGCACAAACTG/R：AATTTCCACATCGCCAAGAG，β-Tubulin基因所用引物為F：GGAGTTCACAGAGGCAGAG/R：CACTTACGCATCACATAGCA。qRT-PCR利用OneStepSYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit [Code No.RR066A，寶生物工程(大連)有限公司)]試劑盒在Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR儀(伯樂，美國)上進行測定。采用2-ΔΔCt法對實驗數(shù)據(jù)進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用 SAS 9.2統(tǒng)計軟件進行各處理差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生大豆耐草甘膦鑒定及高耐材料篩選

草甘膦噴施處理野生大豆7 d后，264份野生大豆材料全部死亡(基本株數(shù)為30株，下同)，藥害等級為5級，占30.64%；450份材料存活株數(shù)在5株以內(nèi)，藥害等級為4級，占52.20%；82份材料存活6～14株，藥害等級為3級，占9.51%；42份材料存活15～24株，藥害等級為2級，占4.87%；24份材料存活25～29株，藥害等級為1級，占2.78%。其中藥害等級為1、2級的野生大豆材料見表2。材料Yong-33在噴施1.125 kg a.i·hm-2草甘膦7 d后，植株存活率達96.67%。

表2 草甘膦處理后藥害等級為1、2級的野生大豆材料Table 2 The wild soybean materials of phytotoxicity grade 1 and 2 with glyphosate treatment

2.2 草甘膦處理對野生大豆MDA及莽草酸含量的影響

草甘膦處理后，高耐草甘膦野生大豆材料Yong-33 的MDA和草甘膦含量與對照(噴施清水)相比，在0、3、10、24、48 h均無顯著差異。敏感材料2010-1的MDA和草甘膦含量在0、3、10、24、48 h與對照相比均顯著升高(圖1)。

注：柱上不同字母表示同一檢測時間點內(nèi)差異顯著(P<0.05)。下同。Note：The different letters indicates significant difference at the same time point at 0.05 level. The same as following.圖1 草甘膦處理對野生大豆MDA和莽草酸含量的影響Fig.1 Effects of glyphosate treatment on the contents of MDA and shikimic acid in wild soybean

圖2 草甘膦處理對野生大豆POD、CAT、SOD活性及葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of glyphosate treatment on POD, CAT and SOD activities and chlorophyll content in wild soybean

2.3 草甘膦處理對野生大豆抗氧化酶系活性及葉綠素含量的影響

草甘膦處理后，高耐草甘膦野生大豆材料Yong-33 的POD、CAT和SOD活性在檢測的各時間點與對照相比均顯著升高。敏感材料2010-1的POD、CAT和SOD活性在檢測的各時間點與對照相比均無顯著差異(圖2-A、B、C)。

噴施草甘膦后，高耐草甘膦野生大豆材料Yong-33 的葉綠素含量在檢測的各時間點與對照相比均無顯著差異。敏感材料2010-1的葉綠素含量在檢測的各時間點與對照相比均顯著降低(圖2-D)。

2.4 草甘膦處理對野生大豆EPSPS基因表達量的影響

由圖3可知，草甘膦處理后，高耐草甘膦野生大豆材料Yong-33的EPSPS基因表達量在檢測的各時間點與對照相比均顯著升高。敏感材料2010-1的EPSPS基因表達量在檢測的各時間點與對照相比均無顯著差異。

圖3 草甘膦處理對野生大豆EPSPS基因表達量的影響Fig.3 Effects of glyphosate treatment on EPSPS gene expression in wild soybean

3 討論

本研究對862份野生大豆材料進行耐草甘膦鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，82.83%的野生大豆材料在噴施1.125 kg a.i·hm-2草甘膦后藥害等級達4級以上；王迪[7]研究了425份野生大豆的草甘膦耐性水平，發(fā)現(xiàn)93.88%的野生大豆材料在草甘膦處理后藥害等級達4級以上；高越等[6]研究了67份野生大豆的草甘膦耐性水平，發(fā)現(xiàn)92.39%的野生大豆材料在草甘膦處理后藥害等級達4級以上；商璐[28]對100份栽培大豆進行草甘膦耐性篩選，發(fā)現(xiàn)95.00%的栽培大豆材料在草甘膦處理后藥害等級達4級以上。以上結(jié)果說明，野生大豆與栽培大豆的草甘膦耐性均較差。但本研究篩選到Y(jié)ong-33等高耐草甘膦的野生大豆材料，說明野生大豆中存在高耐草甘膦的種質(zhì)。所施草甘膦濃度不同可能是造成野生大豆耐性差異的因素，在今后的野生大豆耐草甘膦鑒定中，應(yīng)選擇相同濃度的草甘膦進行處理，以便比較不同研究結(jié)果。

常麗娟等[29]研究發(fā)現(xiàn)，干旱和草甘膦雙重脅迫下耐草甘膦大豆(轉(zhuǎn)基因大豆品種GTS 40-3-2)植株內(nèi)POD和SOD活性均比對照顯著升高，且隨草甘膦濃度升高而升高。原向陽等[30]研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦處理引發(fā)高敏大豆植株保護酶系的活性降低，活性氧代謝失衡，導(dǎo)致質(zhì)膜過氧化。本研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦處理高耐野生大豆材料Yong-33后，植株體內(nèi)活性氧清除酶系POD、CAT和SOD活性均迅速升高，這些酶活性的升高可清除細胞內(nèi)由于草甘膦處理引發(fā)的高水平ROS，該過程對保持細胞活性氧平衡至關(guān)重要。結(jié)合耐草甘膦野生大豆材料在草甘膦處理后MDA及葉綠素含量與對照相比無顯著差異的結(jié)果，說明其細胞內(nèi)未發(fā)生脂質(zhì)過氧化，葉片功能正常。在草甘膦處理后，高敏野生大豆材料POD、CAT和SOD活性與對照相比均無顯著差異，結(jié)合其體內(nèi)MDA含量與對照相比顯著升高。說明在草甘膦處理后高敏野生大豆材料的ROS含量可能升高，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，這可能是導(dǎo)致野生大豆細胞死亡，最終表現(xiàn)葉片黃化、嚴重萎蔫的原因。

草甘膦在植物體內(nèi)的靶標為EPSPS，草甘膦處理植株后，抑制植株EPSPS活性，導(dǎo)致莽草酸在植株體內(nèi)的積累[1]。王迪[7]和商璐[28]的研究結(jié)果均表明，草甘膦處理的耐草甘膦大豆品種植株中，莽草酸含量升高水平顯著低于敏感大豆材料。賈惠舒等[31]研究表明，與對照相比，在草甘膦處理的轉(zhuǎn)GmEPSPS1基因的大豆植株中莽草酸含量顯著降低，并且在濃度為0.5‰和1.0‰草甘膦處理下表現(xiàn)出較低的葉片損傷程度和較好的生長狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，在草甘膦處理后，與對照相比，高耐材料莽草酸含量無顯著差異，高敏材料莽草酸含量顯著升高。說明野生大豆在草甘膦處理后莽草酸含量有升高的趨勢，且升高速率和含量水平可能與植株對草甘膦的耐性強弱有關(guān)。

目前，生產(chǎn)上應(yīng)用的耐草甘膦大豆品種多是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)過表達外源EPSPS基因獲得[23-25,32]，表明EPSPS基因在栽培大豆耐草甘膦脅迫中發(fā)揮重要作用。Gao等[33]研究了野生大豆中EPSPS基因的表達量，發(fā)現(xiàn)在草甘膦處理后，耐性材料中EPSPS1 mRNA水平增加2～4倍。本研究發(fā)現(xiàn)，高耐草甘膦野生大豆植株在草甘膦處理后EPSPS基因表達顯著上調(diào)，可能導(dǎo)致EPSPS酶含量水平升高，補償了草甘膦抑制的EPSPS酶活性，從而提高對草甘膦的耐受性。在草甘膦處理后，高耐野生大豆材料體內(nèi)莽草酸含量與對照相比無顯著差異，進一步印證了上述推論。而敏感材料經(jīng)草甘膦處理后EPSPS基因表達與對照無顯著差異，草甘膦限制了EPSPS酶活性，導(dǎo)致其體內(nèi)莽草酸含量與對照相比顯著升高。

4 結(jié)論

本研究通過對862份野生大豆進行耐草甘膦鑒定，發(fā)現(xiàn)大部分野生大豆草甘膦耐性較差，但存在高耐草甘膦種質(zhì)資源。高耐野生大豆材料在草甘膦處理后植株體內(nèi)活性氧清除酶系活性顯著升高，EPSPS基因表達顯著上調(diào)。敏感材料草甘膦處理后細胞內(nèi)活性氧水平升高。草甘膦處理除影響植株EPSPS酶活性外，對植株活性氧水平也有較大影響。