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        醋酸纖維薄膜電泳緩沖系統(tǒng)置換及緩沖條件優(yōu)化

        2022-05-20 10:09:38易曉華沙元帥曹靖茹郭立忠
        科技視界 2022年10期
        關(guān)鍵詞:區(qū)帶醋酸纖維硼酸

        唐 超 易曉華 沙元帥 曹靖茹 郭立忠

        (青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 青島 266109)

        0 引言

        醋酸纖維薄膜電泳是以醋酸纖維薄膜為分離介質(zhì)的一種水平電泳,它具有分辨率較高、微量、快速等優(yōu)點(diǎn),被廣泛在應(yīng)用血清蛋白、脂蛋白、酶的分離和免疫電泳等方面,是醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等臨床檢驗(yàn)的常規(guī)技術(shù),也是高校動(dòng)物類(lèi)相關(guān)專(zhuān)業(yè)生物化學(xué)經(jīng)常開(kāi)設(shè)的實(shí)驗(yàn)課之一。

        醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)常規(guī)緩沖系統(tǒng)為巴比妥-巴比妥鈉(0.09mol/L,pH8.6),但是巴比妥類(lèi)試劑常被用作神經(jīng)系統(tǒng)鎮(zhèn)靜劑,有一定毒性,對(duì)實(shí)驗(yàn)學(xué)生和生態(tài)環(huán)境造成潛在安全隱患。而且巴比妥類(lèi)試劑屬于國(guó)家管制藥品,價(jià)格較高,不適合大批量采購(gòu)。因此有必要用另一種常見(jiàn)緩沖系統(tǒng)替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖液,同時(shí)優(yōu)化其實(shí)驗(yàn)條件,達(dá)到和巴比妥-巴比妥鈉緩沖系統(tǒng)一樣的實(shí)驗(yàn)效果。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        此次試驗(yàn)選取的初生牛血清。

        1.2 儀器和器材

        電泳儀(北京市六一儀器廠DYY-10C);電泳槽(北京六一儀器廠DYC38B);pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司FE28);醋酸纖維薄膜(路橋四甲生化塑料廠2cm×8cm)。

        1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        緩沖系統(tǒng)優(yōu)化:選用以下5種常見(jiàn)緩沖系統(tǒng),離子強(qiáng)度、pH值與巴比妥緩沖系統(tǒng)相同(0.09mol/L,pH8.6)。NaHPO-KHPO、Tris-HCl、硼酸-四硼酸鈉、四硼酸鈉-HCl、甘氨酸-NaOH。

        電極緩沖液離子強(qiáng)度優(yōu)化:從上述緩沖液中選定一種有可能替代巴比妥緩沖系統(tǒng)的緩沖液,并優(yōu)化其離子強(qiáng)度,第一次粗分級(jí)試驗(yàn):0.10mol/L、0.13mol/L、0.15mol/L、0.18mol/L、0.21mol/L、0.25mol/L、0.30mol/L、0.35mol/L、0.40mol/L;第二次細(xì)分級(jí)試驗(yàn):0.20mol/L、0.22mol/L、0.24mol/L、0.26mol/L、0.28mol/L。

        電極緩沖液pH值優(yōu)化:用pH計(jì)調(diào)節(jié)緩沖液pH值。第一次粗分級(jí)試驗(yàn):pH8.0、pH8.2、pH8.4、pH8.7、pH9.0;第二次細(xì)分級(jí)試驗(yàn):pH8.70、pH8.79、pH8.85、pH8.92、pH9.00、pH9.05、pH9.08。

        電極緩沖液重復(fù)應(yīng)用次數(shù)優(yōu)化:將電泳后的電極緩沖液倒在燒杯中,混勻后作為下一次電泳的電極緩沖液。重復(fù)應(yīng)用次數(shù)設(shè)定為:1次、2次、3次、4次、5次、6次。

        1.4 試驗(yàn)方法

        以上各處理重復(fù)6次,除此以外應(yīng)用以下電泳條件和方法。將醋酸纖維薄膜預(yù)浸于電極緩沖液中20min;用鑷子取出,放在濾紙上吸干表面液體;用蓋玻片一端蘸取少量牛血清,在距離醋酸纖維薄膜一端1.5cm處點(diǎn)樣;待樣品滲入薄膜后置于電泳槽上電泳;穩(wěn)壓120V,電泳45min;電泳結(jié)束后用0.5%氨基黑10B染色液染色5min;用脫色液脫色兩次,每次10min。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 緩沖系統(tǒng)優(yōu)化

        牛血清蛋白在巴比妥-巴比妥鈉緩沖系統(tǒng)下能夠明顯區(qū)分出五條帶,見(jiàn)圖1(上正下負(fù),以下同),分別是白蛋白、α1蛋白、α2蛋白、β蛋白和γ蛋白。雖然各種緩沖溶液具有相同的離子強(qiáng)度和pH值,但是由于帶電粒子本身的特性,在相同電場(chǎng)作用下泳動(dòng)速率等情況不同,因此NaHPO-KHPO緩沖系統(tǒng)、Tris-HCl緩沖系統(tǒng)、甘氨酸-NaOH緩沖系統(tǒng)無(wú)法形成有效區(qū)帶。血清蛋白在硼酸-四硼酸鈉和四硼酸鈉-HCl緩沖系統(tǒng)中能夠進(jìn)行有效區(qū)分,但只有4條區(qū)帶??紤]到電泳過(guò)程中會(huì)產(chǎn)熱,硼酸更穩(wěn)定。因此,用硼酸-四硼酸鈉替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖系統(tǒng)是可行的。

        圖1 緩沖系統(tǒng)優(yōu)化結(jié)果

        2.2 電極緩沖液離子強(qiáng)度優(yōu)化

        電極緩沖液中離子強(qiáng)度直接關(guān)系到蛋白質(zhì)的遷移速率,通常離子強(qiáng)度越低,蛋白質(zhì)遷移得越快。但樣品易擴(kuò)散,分辨率下降,同時(shí)緩沖能力弱,溶液pH穩(wěn)定性差。因此,對(duì)緩沖液離子強(qiáng)度的選擇要兼顧這兩方面因素。

        由圖2可知,在離子強(qiáng)度較低的情況下,血清蛋白質(zhì)區(qū)帶較為擴(kuò)散,含量較低的α1蛋白無(wú)法觀察到,分辨率低。隨著離子強(qiáng)度增大,蛋白質(zhì)越易形成較為凝聚的區(qū)帶。圖3中b~e已經(jīng)可以獲得五條較明顯的蛋白區(qū)帶。但由于學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作時(shí)較難把握點(diǎn)樣量,點(diǎn)樣過(guò)多,電泳區(qū)帶過(guò)于凝聚反而會(huì)分辨不清楚。因此離子強(qiáng)度維持在0.22~0.26mol/L之間,既能獲得較好的電泳分辨率,又能夠去除點(diǎn)樣過(guò)多帶來(lái)的弊端。

        圖2 電極緩沖液不同離子強(qiáng)度電泳圖譜

        圖3 電極緩沖液不同離子強(qiáng)度電泳圖譜

        2.3 電極緩沖液pH值優(yōu)化

        蛋白質(zhì)在電泳的過(guò)程中,電極緩沖液的pH值會(huì)影響其帶電性和帶電量,也影響最終的電泳結(jié)果。從圖4可以看出,電極緩沖液越偏堿性,蛋白區(qū)帶越凝聚,當(dāng)pH值在8.7~9.0之間時(shí)能夠清晰地分辨出血清蛋白質(zhì)的五條區(qū)帶。當(dāng)pH>9.0以后,蛋白區(qū)帶過(guò)于凝集,學(xué)生操作如果點(diǎn)樣過(guò)量,反而會(huì)降低分辨率。為了便于觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果,pH8.7~8.8較為適合。

        圖4 電極緩沖液不同pH值電泳圖譜(粗分級(jí)和細(xì)分級(jí))

        2.4 電極緩沖液重復(fù)應(yīng)用次數(shù)優(yōu)化

        由圖5可知,電極緩沖液重復(fù)使用6次后醋酸纖維薄膜譜帶仍然清晰,染色脫色后分辨率較高,并不影響電泳實(shí)驗(yàn)效果。重復(fù)利用電極緩沖液不但可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本,還可以減少環(huán)境污染。

        圖5 電極緩沖液重復(fù)利用次數(shù)電泳結(jié)果

        3 討論

        醋酸纖維薄膜電泳具有操作簡(jiǎn)便、分辨率較高、應(yīng)用較廣等特點(diǎn),尤其適合在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用。操作過(guò)程中需要準(zhǔn)備的主要試劑就是電極緩沖液,其組成試劑是否容易購(gòu)置、價(jià)格合理,是醋酸纖維薄膜電泳能否在基層得到廣泛應(yīng)用的前提。硼酸和四硼酸鈉是常見(jiàn)的化學(xué)試劑,價(jià)格低廉,無(wú)毒無(wú)污染,還可以重復(fù)應(yīng)用,是可以替換巴比妥緩沖系統(tǒng)的環(huán)保試劑。也可以將硼酸-四硼酸鈉根據(jù)生產(chǎn)和科研需要制作成試劑盒,進(jìn)行快速溶解,省時(shí)省力。

        影響醋酸纖維薄膜電泳結(jié)果的因素很多,除了緩沖系統(tǒng)組成、離子強(qiáng)度、pH值、電壓、電流以外,醋酸纖維薄膜的質(zhì)量也是影響電泳效果的重要因素。本試驗(yàn)在分辨率較高的情況下,不同血清蛋白質(zhì)遷移率比較接近,集中在醋酸纖維薄膜中間部位,這與不同廠家生產(chǎn)的醋酸纖維薄膜孔隙度、均勻度、厚度等都有密切關(guān)系。以后可以對(duì)不同廠家的醋酸纖維薄膜進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn),在保證分辨率的前提下,增加各種蛋白質(zhì)遷移率的差異,提高觀察效果。

        綜上所述,在醋酸纖維薄膜電泳中,硼酸-四硼酸鈉可以替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖系統(tǒng),離子強(qiáng)度在0.22~0.26mol/L之間,pH值在8.7~8.8之間較為適合,重復(fù)應(yīng)用6次也不會(huì)影響電泳效果。

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