王曉娟 董 娜 劉世瓊

胃癌是胃最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病原因主要是與幽門(mén)螺桿菌感染以及長(zhǎng)期的胃部慢性良性疾病等有關(guān)[1]。胃癌早期可毫無(wú)癥狀，少數(shù)出現(xiàn)上腹部飽脹不適、隱痛、反酸、噯氣等非特異性的上消化道癥狀，胃竇癌常出現(xiàn)類似十二指腸潰瘍的癥狀，按慢性胃炎和十二指腸潰瘍常規(guī)治療，癥狀可暫時(shí)緩解，易被忽視[2]。若不能及時(shí)得到有效治療，可能會(huì)發(fā)展為較嚴(yán)重的晚期胃癌。臨床可根據(jù)較宏觀的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤直徑、腫瘤浸潤(rùn)程度判斷胃癌病理分期[3]。胃癌主要是通過(guò)手術(shù)及放化療進(jìn)行治療，且治療后患者需要較長(zhǎng)一段時(shí)間的康復(fù)期，所以臨床一般講究“早發(fā)現(xiàn)、早治療、早康復(fù)”[4]?；颊咧委熀笥行У念A(yù)后指標(biāo)不僅能夠較直觀具體的體現(xiàn)患者恢復(fù)情況，也能夠評(píng)估患者治療方式或治療藥物的臨床療效[5]。但是臨床診斷及相關(guān)預(yù)后指標(biāo)一般都是一些較宏觀的指標(biāo)。當(dāng)胃癌相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)發(fā)生細(xì)微變化，且并未出現(xiàn)宏觀表現(xiàn)時(shí)，較難被診斷出來(lái)，當(dāng)胃癌相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)由量變發(fā)生質(zhì)變，出現(xiàn)宏觀表現(xiàn)時(shí)，治療難度亦增加，預(yù)后也會(huì)受到影響。胃動(dòng)蛋白2(Gastrokine 2，GKN2)、趨化因子17(C-C Motif Chemokine Ligand 17，CCL17)均是胃癌相關(guān)微觀生物學(xué)指標(biāo)[6]。本研究將通過(guò)分析GKN2、CCL17表達(dá)水平，探討其與胃癌病理分期及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年10月～2019年8月在我院收治的152例胃癌患者作為觀察組，其中男性108例，女性44例；年齡30～75歲，平均年齡(50.35±3.74)歲；其中早期患者32例，進(jìn)展期患者83例，晚期患者37例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《胃癌治療指南》中對(duì)胃癌病理分期的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7]；②所選患者均知情并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①依從性差，無(wú)法配合完成本研究；②病歷資料不詳細(xì)；③合并惡性腫瘤、精神系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病病史者。另選取同一時(shí)期于我院行體檢查健康的70例患者作為對(duì)照組，其中男性38例，女性32例；年齡31～75歲，平均年齡(51.13±3.24)歲。

1.2 研究方法

CCL17表達(dá)水平測(cè)定：采用過(guò)氧化物酶免疫組織化學(xué)技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。將152例胃癌患者及50例體檢健康患者組織標(biāo)本采用石蠟常規(guī)切片，切成4～5 μm左右切片標(biāo)本后，置于涂好多聚賴氨酸的玻片上。于68℃烤片機(jī)進(jìn)行烘烤，持續(xù)4 h左右。于二甲苯及酒精中進(jìn)行組織脫蠟，隨后用蒸餾水連續(xù)沖洗3次，每次持續(xù)3分鐘左右，于pH值為7.4酸堿度下進(jìn)行PBS沖洗3次，每次持續(xù)5 min[8]。在所選切片上需滴加3%H2O2溶液1滴進(jìn)行孵育，持續(xù)15 min左右，結(jié)束后重復(fù)進(jìn)行上述沖洗步驟。沖洗后于切片滴加CCL17多克隆抗體(Abnova中國(guó)區(qū)域總代理艾美捷科技有限公司，貨號(hào)：H00006361-A01)1滴，繼續(xù)孵育30 min，PBS沖洗10 min左右[9]。所選切片于室溫下逐個(gè)滴加DAB顯色液，實(shí)用實(shí)驗(yàn)室顯微鏡查看顯色結(jié)果后進(jìn)行自來(lái)水沖洗。所選切片逐個(gè)滴加蘇木精進(jìn)行復(fù)染1 min左右，自來(lái)水沖洗后返藍(lán)10 min左右[10]。最后逐步進(jìn)行梯度酒精脫水及二甲苯透明操作，采用中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察染色結(jié)果。GKN2表達(dá)水平測(cè)定：同上述操作步驟，將上述操作步驟中CCL17多克隆抗體更換為GKN2抗體(上海博耀生物科技有限公司，貨號(hào)：E-EL-H2054)。

1.3 結(jié)果判定

先于低倍鏡下觀察切片，選取染色較均勻區(qū)域，再于高倍鏡下選取5個(gè)不重疊視野范圍，對(duì)每個(gè)視野范圍進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，規(guī)定每個(gè)范圍內(nèi)有200個(gè)腫瘤細(xì)胞方便后續(xù)統(tǒng)計(jì)及比較。根據(jù)每個(gè)區(qū)域內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞率及著色強(qiáng)度對(duì)5個(gè)區(qū)域進(jìn)行評(píng)分[11]。陰性：僅細(xì)胞核核膜上著色為黃色或未著色；陽(yáng)性：細(xì)胞漿及細(xì)胞核核膜上呈現(xiàn)明顯淡黃色、黃色或橙色。著色強(qiáng)度：著色結(jié)果為陰性、淡黃色、黃色或橙色，分別計(jì)分0、1、2、3分。陽(yáng)性細(xì)胞率：每個(gè)視野范圍內(nèi)結(jié)果為陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)占200個(gè)細(xì)胞數(shù)百分比。<10%計(jì)0分，10%～25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，>50%計(jì)3分。每個(gè)區(qū)域內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞率及著色強(qiáng)度相加之和為蛋白表達(dá)水平。0分：不表達(dá)，1～2分：低表達(dá)，3～4分：中表達(dá)，5～6分：高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(n)及百分率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，多因素分析兩組患者GKN2、CCL17表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)關(guān)系及1年內(nèi)生存率及復(fù)發(fā)率的相關(guān)性。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)=0.05，當(dāng)P<0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組GKN2、CCL17陽(yáng)性表達(dá)率比較

觀察組GKN2陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；觀察組CCL17陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組GKN2、CCL17陽(yáng)性表達(dá)比較(例，%)

2.2 GKN2、CCL17表達(dá)水平與胃癌病理分期和預(yù)后的關(guān)系

GKN2、CCL17表達(dá)水平與腫瘤組織分化程度無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)，與病理分期及預(yù)后顯著相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 GKN2、CCL17表達(dá)水平與胃癌病理分期和預(yù)后的關(guān)系/例

2.3 多因素分析GKN2、CCL17表達(dá)水平與胃癌患者病理分期和預(yù)后相關(guān)性

多因素分析顯示：GKN2、CCL17表達(dá)通過(guò)影響患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤直徑及浸潤(rùn)程度，從而影響病理分期，也影響著預(yù)后(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 GKN2、CCL17表達(dá)與胃癌患者病理分期和預(yù)后的相關(guān)性

3 討論

胃癌是全世界發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，我國(guó)也屬胃癌高發(fā)的國(guó)家，病死率占各種惡性腫瘤之首[12]。本病任何年齡均可發(fā)生，但好發(fā)于中年男性，40～60歲年齡組約占全部病例的三分之二，男女之比2～3 ∶1[13]。孫珂等[14]發(fā)現(xiàn)胃癌的主要是由于幽門(mén)螺桿菌感染導(dǎo)致發(fā)生炎癥反應(yīng)，根據(jù)幽門(mén)螺桿菌感染后嚴(yán)重程度，逐漸發(fā)展為胃炎、胃潰瘍到胃癌。目前，對(duì)于患者診斷及預(yù)后指標(biāo)不僅限于宏觀腫瘤病理指標(biāo)，相關(guān)微觀生物學(xué)指標(biāo)逐漸開(kāi)始占據(jù)一席之地，其相關(guān)微觀生物學(xué)指標(biāo)的具體量化表達(dá)，更直觀、詳細(xì)、具體[15]?；颊唧w內(nèi)任何一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)的微量變化都能夠被精確檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果推斷患者所處的病理時(shí)間段及病理原因，更詳細(xì)具體的檢測(cè)結(jié)果也能夠?yàn)榛颊咛峁└哂嗅槍?duì)性及精確性的治療方案?？s小了對(duì)患者治療的治療面，更為針對(duì)性及準(zhǔn)確性的治療方式及治療藥物也能發(fā)揮更有效、更穩(wěn)定、更快速的臨床療效。能夠?yàn)槲赴┰\斷及治療和預(yù)后相關(guān)醫(yī)學(xué)知識(shí)的擴(kuò)展及醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步提供微觀生物學(xué)方面的理論依據(jù)。

CCL17是一種單核/巨噬細(xì)胞趨化因子，屬于CC趨化因子亞族，趨化因子在炎癥反應(yīng)中其關(guān)鍵作用，可以因應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染、病毒感染由多種細(xì)胞釋放，釋放通常由炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素1 刺激引起[16]。能夠吸引單核/巨噬細(xì)胞到炎癥部位，其主要作用是作為白細(xì)胞的趨化劑，從血液中吸引單核細(xì)胞、中性粒巨噬細(xì)胞和其他效應(yīng)細(xì)胞到感染或組織損傷的部位引起免疫應(yīng)答[17]。胃動(dòng)蛋白是一種在胃部能夠特異性表達(dá)的腫瘤抑制因子，能夠在胃部發(fā)生感染時(shí)，通過(guò)保護(hù)胃黏膜、促進(jìn)胃黏膜修復(fù)達(dá)到保護(hù)胃部的作用，作為一種抑癌基因，能夠抑制癌癥的發(fā)生及發(fā)展，GKN2就是其中一種[18]。臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，觀察組GKN2表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組；觀察組CCL17表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組；提示GKN2、CCL17表達(dá)水平與患者胃癌發(fā)生密切相關(guān)。結(jié)果顯示，GKN2、CCL17表達(dá)水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤直徑、浸潤(rùn)程度及一年內(nèi)生存率及復(fù)發(fā)率關(guān)系顯著相關(guān)，表明GKN2、CCL17表達(dá)水平通過(guò)影響胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤直徑、浸潤(rùn)程度等參與了胃癌的發(fā)展過(guò)程。GKN2能夠通過(guò)減少胃癌細(xì)胞在增殖過(guò)程中所需的細(xì)胞周期蛋白D1及E1和基質(zhì)金屬蛋白酶9，將胃癌細(xì)胞遷移增殖過(guò)程停留在G1～S分裂期，在胃癌發(fā)展中起抑制作用[19]。CCL17在胃癌發(fā)展中起促進(jìn)作用，研究顯示，CCL17能夠與其受體CC趨化因子受體4(CC chemokine receptor 4，CCR4)發(fā)生特異性結(jié)合，引起Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境聚集，過(guò)度聚集會(huì)引起免疫反應(yīng)中的T淋巴細(xì)胞抑制，進(jìn)而增加幽門(mén)螺桿菌感染的幾率及嚴(yán)重程度，進(jìn)而加重患者炎癥反應(yīng)，引起CCL17趨化作用，形成惡性循環(huán)[20]。所以GKN2、CCL17表達(dá)水平也能夠作為胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)。多因素分析結(jié)果顯示，GKN2低表達(dá)、CCL17高表達(dá)是影響胃癌病理分期及預(yù)后的顯著危險(xiǎn)因素。

綜上所述，GKN2低表達(dá)、CCL17高表達(dá)能夠用來(lái)作為判定胃癌病理分期的相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)，也是影響胃癌預(yù)后的顯著危險(xiǎn)因素。