李雪利，汪思源，翟征遠，林建涵，郝彥玲

（1.中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學 信息與電氣工程學院，北京100083）

0 引言

獸用抗生素在治療動物疾病方面發(fā)揮重要作用，其中四環(huán)素類抗生素是治療奶牛乳房炎常用抗生素[1]，而抗生素的殘留會導致耐藥微生物的出現(xiàn)。蠟樣芽孢桿菌是一種廣泛存在于土壤、污水和空氣等環(huán)境中的革蘭氏陽性菌[2]，在不利的生長條件下能產(chǎn)生抗逆性極強的芽孢，當環(huán)境適宜時，芽孢又可萌發(fā)成菌體細胞[3]，因此，蠟樣芽孢桿菌的芽孢能夠經(jīng)受巴氏滅菌，被認為是巴氏殺菌乳中主要殘留微生物[4]。Yusuf等[5]從乳制品中分離出19株耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌，Cui等[6]從生牛乳和奶牛場環(huán)境分離出16株耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌。由此可知，耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌在乳制品中廣泛存在。Bernhard等[7]證實蠟樣芽孢桿菌中四環(huán)素抗性質(zhì)粒PBC16可轉(zhuǎn)移到枯草芽孢桿菌，AgersO等[8]檢測到蠟樣芽孢桿菌中四環(huán)素耐藥基因可轉(zhuǎn)移至金黃色葡萄球菌和腸球菌。因此，蠟樣芽孢菌中的四環(huán)素耐藥基因的轉(zhuǎn)移性會給人類健康帶來嚴重的威脅。

基于培養(yǎng)方法的微生物耐藥表型檢測，因靈敏性差，耗時長，無法實現(xiàn)快速檢測[9]。而分子生物學檢測技術(shù)可實現(xiàn)快速準確的檢測，其中環(huán)介導等溫擴增（LAMP）是由Notomi等[10]建立的一種恒溫核酸擴增技術(shù)，能夠在恒溫條件下實現(xiàn)目標基因的快速、特異性檢測。免疫磁珠分離（IM S）是一種能將目標菌與干擾菌快速分離的方法[11]，現(xiàn)已在單增李斯特菌[12]、沙門氏菌[13]、大腸桿菌[14]、蠟樣芽孢桿菌[15]的富集上廣泛應用。將IMS與LAMP檢測技術(shù)結(jié)合，已成為一種新型檢測目標菌的方法。目前已有文獻利用IMS-LAMP方法快速檢測牛肉中的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌[16]、海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌[17]和霍亂弧菌[18]、牛奶中的大腸桿菌O157:H 7[19]和雞肉中的沙門氏菌[20]，但在巴氏殺菌乳中利用IMS-LAMP方法快速檢測耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌的研究尚未見報道。本研究將IMS技術(shù)與LAMP技術(shù)相結(jié)合實現(xiàn)巴氏殺菌乳中蠟樣芽孢桿菌四環(huán)素耐藥基因tetL的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

耐復方新諾明蠟樣芽孢桿菌BA008、耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌BA117、耐克林霉素地衣芽孢桿菌BA130、耐克林霉素短小芽孢桿菌BA102、大腸桿菌ATCC 80739為實驗室保存。

1.1.2 試劑

鏈霉親和素納米磁珠，Ocean Nanotech公司；生物素標記的芽孢桿菌抗體，EastCoast Bio公司；WarmStartRLAMP Kit(DNA&RNA)，New England BioLabs公司；牛血清蛋白（BSA），EM Science公司；氯化鈉和胰蛋白胨，Oxoid公司；牛肉浸粉，北京奧博星生物公司；吐溫-20，Amresco公司；1×PBS（磷酸鹽緩沖液），Sigma Aldrich公司；1×PBST（PBS中加入0.05%Tween-20）；其它試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。巴氏殺菌乳，市售。

1.1.3 儀器設備

實時熒光定量PCR儀，BIO-RAD公司；場發(fā)射透射電鏡，北京中科百測公司；恒溫培養(yǎng)箱和磁力架，Thermo Fisher Scientific公司；超聲儀，福建致微儀器公司；垂直混勻儀，上海強運公司；低速離心機，寧波拓普森儀器公司；Milli-Q超純水儀，Millipore Advantage公司；電子天平，Mettler Toledo公司；恒溫搖床，Benchmarker公司；小型渦旋振蕩器，Scientific Industries公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫磁珠的制備

向20μL 150 nm磁珠溶液（1 mg/mL）加入500μL PBST（0.01 mol L-1，p H 7.4），清洗磁珠3次，在磁力架上回收磁珠3 min，沉淀用500μL PBS（0.01 mol L，p H 7.4）重懸，然后加入適量的2.5 mg/mL芽孢桿菌抗體，混勻后置于垂直混勻儀上室溫反應；反應完的溶液在磁力架上靜置3 min棄去上清，用500μL PBST（0.01 mol/L，p H 7.4）洗滌1次，棄上清，免疫磁珠用PBS（0.01 mol/L，p H 7.4）重懸至終濃度為1 mg/m L，并于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 免疫磁珠富集條件優(yōu)化

1.2.2.1 抗體使用量的優(yōu)化

向清洗后的20μL磁珠溶液中分別加入0、2.5、5、7.5、10μg芽孢桿菌抗體，按1.2.1制備免疫磁珠。取20μL免疫磁珠加入500μL含有103CFU/m L耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌的人工污染乳，于混勻儀上反應1 h，磁力架上靜置3 min，沉淀用PBS重懸并涂于營養(yǎng)瓊脂平板，30℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)，并計算捕獲效率。

捕獲效率（%）=（免疫磁珠富集的菌落數(shù)/免疫磁珠富集前菌落數(shù)）×100%

1.2.2.2 免疫磁珠用量的優(yōu)化

按1.2.1制備免疫磁珠，取免疫磁珠10、15、20、25、30μL，分別加入500μL含有103CFU/m L耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌的人工污染乳，在混勻儀上反應1 h后，磁力架上靜置3 min，沉淀用PBS重懸并涂于營養(yǎng)瓊脂平板，30℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)，并計算捕獲效率。

1.2.2.3 免疫磁珠捕獲時間的優(yōu)化

按1.2.1制備免疫磁珠，取最適添加量的免疫磁珠加到500μL含有103CFU/mL耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌的人工污染乳，分別在混勻儀上反應30、45、60、75、90 min，磁力架上靜置3 min，沉淀用PBS重懸并涂于營養(yǎng)瓊脂平板，30℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)，并計算捕獲效率。

1.2.2.4 透射電鏡觀察免疫磁珠—目標菌復合物

按1.2.1制備免疫磁珠，取最適添加量的免疫磁珠加到500μL含有107CFU/mL耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌的人工污染乳，在最佳免疫時間內(nèi)于混勻儀上反應，磁力架上靜置3 min，沉淀用dd H2O重懸，吸取10μL免疫磁珠—蠟樣芽孢桿菌的混合懸液滴加于載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置干燥過夜，用于后續(xù)透射電鏡觀察。

1.2.3 LAMP檢測方法的建立

1.2.3.1 DNA模板制備及引物的合成

利用優(yōu)化后的條件富集巴氏殺菌乳中的耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌，將富集的目標菌置于金屬浴100℃熱裂解10 min，冰浴5 min，10 000 rpm離心1 min，取上清作模板，-20℃保存。

使用軟件Primer Explorer V4設計蠟樣芽孢桿菌四環(huán)素耐藥基因tetL的引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 LAMP反應引物

LAMP反應體系為25μL，各成分為：外引物（F3和B3）各0.2μmol/L、內(nèi)引物（FIP和BIP）各1.6μmol/L、環(huán)引物（Loop B）0.4μmol/L，DNA模板5μL，染料0.5μL，超純水補充體積至25μL。LAMP反應在實時熒光定量PCR儀上進行，反應條件為：65℃、1 min，共44個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號。

1.2.3.2 LAMP引物的特異性

按1.2.3.1方法檢測濃度為103CFU/mL的大腸桿菌，根據(jù)擴增曲線判定該LAMP引物的特異性。

1.2.4 人工污染乳中蠟樣芽孢桿菌耐四環(huán)素tetL基因的檢測

取25 mL巴氏殺菌乳與225 mL PBS充分混勻，將耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌梯度稀釋至2.4×103~2.4 CFU/mL，用建立的IMS-LAMP方法檢測，確定該方法檢測巴氏殺菌乳中蠟樣芽孢桿菌四環(huán)素耐藥基因tetL的檢測限。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均做3次生物學重復，根據(jù)3次實驗結(jié)果計算平均值和標準偏差，采用Graphpad Prism 7.0軟件中t檢驗比較兩組間的均值，并將P≤0.05確定為統(tǒng)計學上的顯著性閾值[17]。

2 結(jié)果

2.1 抗體用量優(yōu)化

取不同體積的芽孢桿菌抗體和20μg磁珠偶聯(lián)制備免疫磁珠，結(jié)果如圖1所示，當抗體用量從2.5μg增加到7.5μg時，捕獲效率從53.1%增加到66.0%，隨著抗體用量增加，對蠟樣芽孢桿菌BA117的捕獲效率沒有明顯提高（P＞0.05）。因此，每微克磁珠偶聯(lián)抗體的最佳用量為375 ng。

圖1抗體用量優(yōu)化

2.2 免疫磁珠用量優(yōu)化

向反應體系添加不同量的免疫磁珠捕獲蠟樣芽孢桿菌BA117，根據(jù)捕獲效率確定實驗最佳的免疫磁珠用量。從圖2可知，當免疫磁珠添加量為25μL時，捕獲效率達68.0%。隨著免疫磁珠用量增加，對蠟樣芽孢桿菌BA117的捕獲效率有所降低，但不顯著（P＞0.05）。故選用25μL作為免疫磁珠最適添加量。

2.3 免疫時間優(yōu)化

將25μL免疫磁珠和蠟樣芽孢桿菌BA117菌液進行不同時間的孵育后，計算捕獲效率。結(jié)果如圖3所示，當免疫時間在30~60 min時，隨著免疫時間的增加，捕獲率由31.5%顯著增加至68.1%（P＜0.05）；當免疫時間大于60 min，捕獲效率隨著免疫時間的增加而降低至55.7%（P＜0.05）。因此選擇60 min作為最佳免疫時間。

圖2免疫磁珠用量優(yōu)化

圖3免疫時間優(yōu)化

2.4 免疫磁珠特異性實驗

選取3株芽孢桿菌和1株大腸桿菌對免疫磁珠進行了特異性檢測，從圖4可以看出，免疫磁珠對3株芽孢桿菌的捕獲效率分別是蠟樣芽孢桿菌BA008為68.9%、地衣芽孢桿菌BA130為50.8%、短小芽孢桿菌BA102為45%，而免疫磁珠對大腸桿菌捕獲率僅為1.1%，證明本實驗所用免疫磁珠對蠟樣芽孢桿菌具有很高的特異性。

圖4免疫磁珠特異性檢測

此外，為了進一步確認免疫磁珠和蠟樣芽孢桿菌的免疫結(jié)合，利用透射電鏡對免疫磁珠-蠟芽孢桿菌BA117復合物進行觀察，證明免疫磁珠捕獲到了目標菌。

圖5免疫磁珠-蠟樣芽孢桿菌復合物

2.5 LAMP引物特異性檢測

選取大腸桿菌作為非目標菌檢測LAMP引物特異性，結(jié)果如圖6所示，只有攜帶四環(huán)素耐藥基因tetL的蠟樣芽孢桿菌BA117有擴增曲線，大腸桿菌呈陰性結(jié)果。證明所設計的LAMP引物具有良好的特異性，與非目標菌不存在交叉反應。

圖6 LAMP引物特異性檢驗

2.6 IMS-LAMP檢測技術(shù)的靈敏度

用建立的IMS-LAMP方法檢測巴氏殺菌乳中2.4×103~2.4 CFU/mL的耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌BA117，結(jié)果如圖7所示，該方法可檢測到巴氏殺菌乳中24 CFU/mL的耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌BA117。

圖7 IMS-LAMP技術(shù)的靈敏度

3 討論

在實際檢測巴氏殺菌乳中耐藥蠟樣芽孢桿菌時，由于基質(zhì)復雜，同時可能存在其它菌的干擾，很難對目標菌進行高靈敏、高特異性的檢測，因此在進行LAMP檢測前需要對樣品進行前處理。苑學霞等[21]為了提高LAMP檢測牛奶中致病微生物的靈敏度，增加了18~24 h增菌處理，柏建山等[22]在建立LAMP檢測乳粉中阪崎腸桿菌方法時，通過對樣品進行18~22 h的增菌培養(yǎng)降低了檢出限。雖然通過增菌處理降低了LAMP檢測方法的檢出限，但是延長了檢測時間，無法實現(xiàn)快速檢測。IMS是一種無需微生物增菌并能消除食品基質(zhì)影響的前處理方法，可以對樣品中的目標菌進行快速富集[16]，目前已有文獻利用免疫磁珠富集牛奶、食品和蔬菜中的蠟樣芽孢桿菌[23-24]。因此，我們建立了IMSLAMP方法快速檢測巴氏殺菌乳中耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌，包括免疫磁珠富集樣品中耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌（60 min），熱裂解快速獲取目標DNA（20 min），LAMP擴增tetL四環(huán)素耐藥基因（50 min），該方法在2 h內(nèi)對耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌的檢出限可達2.4 CFU/mL。

本實驗選用了鏈霉親和素標記磁珠和生物素標記芽孢桿菌多抗制備免疫磁珠，對巴氏殺菌乳中耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌進行富集。當不添加抗體時，鏈霉親和素磁珠對目標菌的捕獲率約40%，推測可能是磁珠表面的鏈霉親和素和蠟樣芽孢桿菌表面蛋白非特異性吸附造成的。此外，在優(yōu)化的最適條件下，免疫磁珠對巴氏殺菌乳中103CFU/m L耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌的捕獲率為68.1%，當免疫時間延長，并沒有提高捕獲效率，可能是由于抗體和蠟樣芽孢桿菌表面蛋白結(jié)合力不強，反應過程的輕搖振蕩導致蠟樣芽孢桿菌和免疫磁珠的分離。此外，本實驗選用的LAMP試劑盒配有熒光染料，使LAMP反應可以在實時熒光定量PCR儀上進行實時檢測，既避免了開蓋造成氣溶膠污染，也避免了肉眼觀察造成誤差，提高了檢測靈敏度。值得注意的是，DNA的提取也是提高LAMP檢出限的關(guān)鍵因素，本研究由熱裂解5 min改為熱裂解10 min，冰浴5 min，檢出限提高了一個數(shù)量級。

在實際生產(chǎn)的巴氏殺菌乳中芽孢桿菌污染濃度低于103CFU/mL[25]，因此本實驗選取含有103CFU/m L耐四環(huán)素蠟樣芽孢桿菌的巴氏殺菌乳作為實驗對象。此外，GB 19645—2010《食品安全國家標準 巴氏殺菌乳》中微生物限量規(guī)定金黃色葡萄球菌和沙門氏菌不得檢出，大腸菌群最大限量為2 CFU/m L[26]，故將大腸桿菌作為檢測過程中的干擾菌。本研究結(jié)果證實了IMS-LAMP方法檢測蠟樣芽孢桿菌四環(huán)素耐藥基因tetL的可行性，今后將進一步利用該方法檢測蠟樣芽孢桿菌中其它具有潛在轉(zhuǎn)移的耐藥基因，建立高通量耐藥基因的檢測方法，為乳制品中耐藥芽孢桿菌的快速檢測提供新的方法。