湯木果，陳曉琴，趙存朝,2，陶亮,2,3，田洋,2,3,4

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院，昆明650201；2.國家辣木加工技術研發(fā)專業(yè)中心，昆明650201；3.云南省生物大數(shù)據(jù)重點實驗室，昆明650201；4.食藥同源資源開發(fā)與利用教育部工程研究中心，昆明650201)

0 引言

我國乳酸菌飲料產(chǎn)于上世紀80年代，起因是國內(nèi)有患有乳糖不耐癥的人，不能很好的消化吸收牛乳中的乳糖，乳酸菌飲料的出現(xiàn)很好的解決了上述問題[1]。焦香型乳酸菌飲料是以有機脫脂奶粉為原料，添加還原糖經(jīng)美拉德反應、接種、發(fā)酵、破乳、調(diào)配、均質(zhì)而制成的色、香、味俱全并具有清爽口感、酸甜適中的乳酸菌飲料[2]。焦香型的產(chǎn)生主要是利用添加的葡萄糖與蛋白在高溫下發(fā)生美拉德褐變反應所致，此反應對飲料的pH值、黏度、離心沉淀率均有影響[3-4]。目前，乳酸菌飲料被認為是一種營養(yǎng)豐富、健康型的飲料[5]。同時，乳酸菌飲料也是近年來在我國快速發(fā)展并流行的一類飲料產(chǎn)品[6]，乳酸菌能夠增強人體免疫力[7]，主要是因為機體腸道菌群平衡可以促進食物消化[8]，提升機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，并且在一定程度上還具有延緩人體衰老等功能[9]。根據(jù)中商產(chǎn)業(yè)研究院數(shù)據(jù)可知，乳酸菌飲料在2015年到2019年平均復合增長率是11.2%，截止2019年銷售額為364.8億，預計2020年有望達到389.3億。中國乳酸菌飲品市場需求較高，前景廣闊。

隨著人們健康意識的不斷提升，乳制品行業(yè)競爭越發(fā)激烈，為了滿足當前消費者對于“營養(yǎng)、健康、安全、好喝、時尚”的含乳飲品的追求，開發(fā)一款焦香型乳酸菌飲料，不僅可以豐富乳酸菌飲料制品的產(chǎn)品種類，相較于其他乳酸菌飲料，其具有健康、營養(yǎng)、好喝、易消化，且適合各個年齡階段人飲用。目前，國內(nèi)外已有水果發(fā)酵酸乳、谷物蛋白發(fā)酵飲料等的研究，但焦香型乳酸菌飲料的研究較少。本研究以有機脫脂奶粉為主要原料研發(fā)一款口感清爽、酸甜適中且健康的焦香型乳酸菌飲料，這不僅可以豐富乳酸菌飲料產(chǎn)品品類，也可為乳酸菌飲料的實際生產(chǎn)提供一定的理論以及技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

有機脫脂奶粉，天津銀河偉業(yè)進出口有限公司；食用葡萄糖、白砂糖，景谷洋浦南華糖業(yè)有限公司；大豆多糖（B20170815）、（B20190515）、復配增稠乳化劑（HBT-A7301）、（HBT-A8355）、（HBT-A8570）、（HBT-A5352），福建省泉州市味博食品有限公司；土耳其菌種、OELVO-YORMY-1821、FD-DVS A BY-8/25X 200U、DELVO-YOGRFVV-231、CHN-22、乳酸菌kT-A8，北京正洺嘉科科貿(mào)有限公司；YFL922、R-707、YoFLexRMild 1.0、mo-30、HarrestLB-1，科漢森菌種生物科技公司。

1.2 儀器與設備

DHP-500電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；HJJ-6水浴恒溫電動攪拌器，常州華奧儀器制造有限公司；p HS-3C雷磁p H計，上海儀電科學儀器股份有限公司；YP5001電子分析天平，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；60-6S高壓均質(zhì)機，上海東華高壓均質(zhì)機廠；旋轉式黏度計，旋轉式黏度計。

1.3 方法

1.3.1 焦香型乳酸菌飲料制作工藝流程

有機脫脂奶粉溶解→溶解葡萄糖→美拉德反應→降溫、接種→低溫長時發(fā)酵→破乳→加入穩(wěn)定劑、白砂糖、乳酸→混勻→過濾→均質(zhì)→分瓶→殺菌→分段冷卻→焦香型乳酸菌飲料

1.3.2 操作要點

（1）有機脫脂乳粉溶解：將有機脫脂奶粉溶于45～48℃蒸餾水中，按料液比1∶10(w/v)溶解，低溫不易溶解，易發(fā)生團聚，高溫使乳清蛋白發(fā)生凝固變性。

（2）穩(wěn)定劑添加：先將物料混勻，水加熱至沸騰，在攪拌的同時加入物料，攪拌到完全溶解為止。時間控制在30 min。

（3）均質(zhì)：均質(zhì)是乳酸菌飲料沉淀的一種有效的物理方法，也是生產(chǎn)中口感是否細膩至關重要的一步。均質(zhì)壓力為20～25 MPa。

（4）殺菌：在85℃條件下殺菌30 min，既要保證充分殺菌，又不能影響焦香型乳酸菌飲料的質(zhì)地及風味。

（5）接種發(fā)酵：接種0.2%菌種發(fā)酵液，在4℃下發(fā)酵48 h，進一步促進焦香型乳酸菌飲料的形成及產(chǎn)酸產(chǎn)香。

（6）冷藏：在4℃條件下冷藏，進一步產(chǎn)酸產(chǎn)香，完善乳酸菌飲料風味和滋味。

1.3.3 美拉德反應條件的篩選及葡萄糖添加量的確定

以感官評分為參考指標，考察美拉德反應條件（溫度/時間：90℃/60 min、90℃/90 min、100℃/90 min、100℃/120 min、120℃/90 min、120℃/120 min）及葡萄糖添加量（5%、10%、15%、20%、25%）。

1.3.4 菌種篩選

在優(yōu)選的美拉德反應溫度、時間和葡萄糖添加量的基礎上，以感官評分、pH值為指標，對直投式乳酸菌種（鼠李糖乳桿菌、乳酸菌k T-A8、土耳其菌種、乳酸菌CHN-22、乳酸菌1821DSL、Mild 1.0菌種、YFL904菌種、R-707菌種）進行篩選。

1.3.5 單因素試驗及響應面優(yōu)化試驗

以感官評分、p H值及酸度為分析指標，考察菌種接種量（%）、乳酸添加量（%）、發(fā)酵時間（h）、白砂糖添加量（%）和穩(wěn)定劑種類及復配穩(wěn)定劑添加量（%）對焦香型乳酸菌飲料的影響；在試驗過程中發(fā)現(xiàn)乳酸添加量（%）、白砂糖添加量（%）對焦香型乳酸菌飲料影響不大；后期優(yōu)化試驗以菌種接種量（%）、發(fā)酵時間（h）和復配穩(wěn)定劑添加量（%）為自變量，以感官評分、p H值及酸度為響應值，通過響應面試驗優(yōu)化焦香型乳酸菌飲料最佳工藝配方。焦香型乳酸菌飲料優(yōu)化試驗因素與水平如表1所示。

表1響應面優(yōu)化試驗的因素及水平

1.3.6 產(chǎn)品指標檢測

1.3.6.1 焦香型乳酸菌飲料感官評定。

選擇10名具有一定感官評定經(jīng)驗的專家對焦香型乳酸菌飲料的色澤（25分）、口感（25分）、滋味與香氣（25分）、組織狀態(tài)（25分）4個方面進行感官評定。每個品評員對每個樣品重復評價3次，取平均值即為感官評分結果。感官評分標準見下表2。

表2焦香型乳酸菌飲料的感官評分標準

1.3.6.2 產(chǎn)品理化指標測定

（1）焦香型乳酸菌飲料p H測定。

p H計進行校準后測量焦香型乳酸菌飲料p H。

（2）焦香型乳酸菌飲料的沉淀率測定。

參考朱彤[10]等方法并稍作修改。稱取30 m L焦香型乳酸菌飲料樣品，4 000 r/min離心20 min，緩慢倒出上清液，然后將離心管倒置30 min后測量離心管底部沉淀量，記為M 1，沉淀率計算公式如下。

式中：M1為離心管倒置30 min后測量離心管底部沉淀量；M2為離心管質(zhì)量；M為樣品質(zhì)量。

（3）黏度的測定。

使用校正后的旋轉式黏度計進行測定3次，結果取平均值。

（4）其他指標測定。

酸度、乳酸菌活菌數(shù)、菌落總數(shù)、霉菌、酵母、大腸菌群的測定：參照GB/T 21732《食品安全國家標準含乳飲料》中相關方法檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2013、SPSS 24對實驗數(shù)據(jù)進行整理及統(tǒng)計分析，利用Design-Expert10.0.1進行響應面分析。

2 結果與討論

2.1 美拉德反應條件對美拉德反應程度的影響

2.1.1 溫度/時間對美拉德反應程度的影響

有機脫脂奶粉中的蛋白質(zhì)等氨基化合物和葡萄糖或其他羰基化合物之間在正常的狀態(tài)下并不會發(fā)生美拉德反應，只有當溫度較高、反應時間較長時才發(fā)生明顯的美拉德反應[10]。美拉德反應使產(chǎn)品具有特殊的色澤和風味[11]。本試驗篩選溫度/時間及葡萄糖添加量，通過產(chǎn)品的顏色深淺比較其美拉德反應程度，通過色澤和風味的感官評定，確定最適的溫度/時間和糖用量。

根據(jù)試驗發(fā)現(xiàn)不同美拉德反應條件對焦香型乳酸菌飲料的感官品質(zhì)有顯著影響。在葡萄糖添加量為20%的條件下，考察溫度/時間對焦香型乳酸菌飲料的影響。在如圖1所示，感官評分最高的美拉德反應條件是100℃/90 min，焦香型乳酸菌飲料呈現(xiàn)褐色顏色適中，有濃郁的焦香味，口感潤滑，無乳清析出，感官評分可達87分，最低的是120℃/120 min，呈現(xiàn)褐色顏色偏深，有異味，口感稀薄略粗糙，有乳清析出。研究表明溫度太低、時間太短，反應較難進行完全，風味物質(zhì)難以呈現(xiàn)出來；但溫度過高、時間過長，會引起焦糖化反應，產(chǎn)生不良風味，甚至蛋白質(zhì)及其他易變性成分會越嚴重[12]。根據(jù)焦香型乳酸菌飲料的組織狀態(tài)、口感、風味、感官評分綜合分析，確定100℃/90 min為焦香型乳酸菌飲料最佳美拉德反應條件。

圖1焦香型乳酸菌飲料美拉德反應條件篩選結果

2.1.2 葡萄糖添加量對美拉德反應程度的影響

還原性糖是美拉德反應中不可少的一類物質(zhì)，葡萄糖屬于還原性糖，可以供給能力及補充體內(nèi)糖分，并且直接參與人體的代謝過程[13]。且葡萄糖添加量會直接影響乳酸菌的口味和色澤。在溫度/時間為100℃/90 min的條件下，考察葡萄糖添加量對焦香型乳酸菌飲料的影響。

圖2葡萄糖添加量對美拉德反應程度的影響

從圖2可知，隨著葡萄糖添加量的增多，感官評分呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，產(chǎn)品顏色越來越深。當葡萄糖添加量為20%時，感官評分最高，此時產(chǎn)品色澤適宜，呈褐色，有獨特的焦香味，酸甜可口；當添加量超過20%時，口感太甜，酸味明顯不足，感官評分出現(xiàn)下降。所以選用20%的葡萄糖添加量為最佳工藝參數(shù)。

2.2 菌種篩選

發(fā)酵菌種對乳酸菌飲料的質(zhì)量品質(zhì)有至關重要的作用，對飲料的風味品質(zhì)、組織形態(tài)均有重要影響[14]。本試驗研究了11種發(fā)酵菌種對焦香型乳酸菌飲料的感官品質(zhì)和p H的影響。

圖3焦香型乳酸菌飲料發(fā)酵菌株篩選結果

如圖3所示，感官評分最高的菌株是FDDVSABY-8/25X 200U，p H值約為3.7，呈現(xiàn)組織狀態(tài)均勻一致、不分層、微量乳清析出，色澤均勻，口感及風味較好。感官評分最低的菌株是R-707，p H值約為3.9，呈現(xiàn)質(zhì)地不均勻，分層、乳清析出，口感及風味差。最終根據(jù)乳酸菌飲料的組織狀態(tài)、口感、風味、感官評分和p H值綜合分析篩選后，選定感官評分最高、口感及風味較好、p H值適宜的直投式FD-DVS ABY-8/25X 200U為焦香型乳酸菌飲料最佳發(fā)酵菌株。

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 發(fā)酵時間和菌種接種量對感官評分、酸度和p H值的影響

根據(jù)焦香型乳酸菌飲料加工工藝流程及操作要點，篩選發(fā)酵時間(0、12、24、36、48、60h)和菌種接種量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%)對焦香型乳酸菌飲料感官評分、酸度和p H值的影響，結果如圖4所示。

圖4發(fā)酵時間（a）、菌種接種量（b）對焦香型乳酸菌飲料感官評分、酸度和pH值的影響

由圖4（a）可知，在菌種接種量為0.2%，乳酸添加量為0.25%，白砂糖添加量為3.5%及復配穩(wěn)定劑為大豆多糖（B20170815）：復配增稠乳化劑（HBT-A7301）其添加量為6%∶2%條件下，考察發(fā)酵時間對焦香型乳酸菌飲料的影響。隨著發(fā)酵時間的延長，p H值呈現(xiàn)逐漸降低、酸度逐漸上升趨勢，感官評分呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。當發(fā)酵時間在48 h時，感官評分最高，達到85.0分。因此，確定發(fā)酵時間為48 h為宜。

在發(fā)酵時間為48 h，乳酸添加量為0.25%，白砂糖添加量為3.5%及復配穩(wěn)定劑為大豆多糖（B20170815）∶復配增稠乳化劑（HBT-A7301）其添加量為6%∶2%條件下，考察菌種接種量對焦香型乳酸菌飲料的影響。由圖4（b）可知，焦香型乳酸菌飲料的感官評分隨著菌種接種量的增加呈現(xiàn)先升高后下降，p H值呈現(xiàn)逐漸下降、酸度呈現(xiàn)逐漸上升趨勢。當菌種接種量在0.20%時，焦香型乳酸菌飲料的感官評價最好，平均得分為85.0分。當菌種接種量添加過少，發(fā)酵不成功，產(chǎn)生異味、黏稠度不高，口感淡等，菌種接種量添加過多造成酸度過高。因此，菌種接種量為0.20%最佳。

2.3.2乳酸添加量及白砂糖添加量對感官評分、酸度和p H值的影響

根據(jù)焦香型乳酸菌飲料加工工藝流程及操作要點，篩選乳酸添加量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%)和白砂糖添加量0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%)對焦香型乳酸菌飲料感官評分、酸度和p H值的影響，結果如圖5。

圖5乳酸添加量（a）、白砂糖添加量（b）對焦香型乳酸菌飲料感官評分、酸度和pH值的影響

乳酸能調(diào)節(jié)酸度、口感、提高貨架期、抑制細菌生長繁殖，使產(chǎn)品口味柔和爽口，與此同時使產(chǎn)品色澤、質(zhì)量也得到保障[15]。由圖5（a）可知，發(fā)酵時間為48 h，乳酸菌種接種量為0.2%，白砂糖添加量為3.5%及復配穩(wěn)定劑為大豆多糖（B20170815）：復配增稠乳化劑（HBT-A7301）其添加量為6%∶2%條件下，考察乳酸添加量對焦香型乳酸菌飲料的影響。隨著乳酸添加量的增加，飲料的p H值逐漸降低、酸度逐漸上升，感官評分呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。當乳酸菌添加量在0.25%時，焦香型乳酸菌飲料的感官評分最高，p H值為3.88，酸度為100°T。當乳酸添加量添加過少，酸度不夠，乳酸添加量添加過多造成酸度過高。因此，乳酸添加量為0.25%最佳。

由圖5（b）可知，發(fā)酵時間為48 h，菌種接種量為0.2%，乳酸添加量為0.25%及復配穩(wěn)定劑為大豆多糖（B20170815）∶復配增稠乳化劑（HBT-A7301）其添加量為6%∶2%條件下，考察白砂糖添加量對焦香型乳酸菌飲料的影響。隨著白砂糖添加量的增加，產(chǎn)品pH值逐漸降低、酸度逐漸上升，感官評分呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。當白砂糖添加量為3.5%時，焦香型乳酸菌飲料的感官評分最高，p H值為4.1、酸度為98°T。當白砂糖添加量添加過少，酸味重，口感差，白糖添加量添加過多造成甜味過重，口感不細膩有雜質(zhì)感。因此，白砂糖添加量為3.5%最佳。

2.3.3 穩(wěn)定劑種類及添加量對感官評分、酸度和p H值的影響

體系穩(wěn)定是乳酸菌飲料質(zhì)量的重要評價指標[16]。因此選擇合適的穩(wěn)定劑種類以及添加量對乳酸菌飲料產(chǎn)生重要影響[17]。本試驗對穩(wěn)定劑種類及添加量進行篩選。

圖6穩(wěn)定劑種類（a）對焦香型乳酸菌飲料感官評分及穩(wěn)定劑添加量（b）對焦香型乳酸菌飲料感官評分、酸度和pH值的影響

從圖6（a）可以看出大豆多糖（B20170815）和復配增稠乳化劑（HBT-A7301）的感官評分最高，最低的是復配增稠乳化劑HBT-A8355。曾研究報道大豆多糖與復配增稠乳化劑混合使用效果均較二者單獨使用更佳[18]。因此本研究以感官評分最高的大豆多糖（B20170815）和復配增稠乳化劑（HBT-A7301）作為復配穩(wěn)定劑制作焦香型乳酸菌飲料。

由圖6（b）可知，發(fā)酵時間為48 h，菌種接種量為0.2%，乳酸添加量為0.25%及白砂糖添加量為3.5%條件下，考察大豆多糖（B20170815）與復配增稠乳化劑（HBT-A7301）添加量對焦香型乳酸菌飲料的影響。感官評分最高的大豆多糖（B20170815）與復配增稠乳化劑（HBT-A7301），其添加量為6%∶2%，p H值為4.03、酸度約為93°T，感官評分最低的大豆多糖（B20170815）與復配增稠乳化劑（HBT-A7301）其添加量為8%∶8%。當復配穩(wěn)定劑添加量添加過少，出現(xiàn)沉淀分層或脂肪上浮，穩(wěn)定劑添加量過多造成口感差。因此，大豆多糖（B20170815）與復配增稠乳化劑（HBT-A7301）添加量為6%∶2%最佳。

2.4 響應面試驗結果與分析

2.4.1 響應面試驗設計及結果分析

在單因素基礎上，優(yōu)化試驗以菌種接種量（%）、發(fā)酵時間（h）和復配穩(wěn)定劑添加量（%）為自變量，以感官評分、p H值及酸度為響應值，利用響應面進行3因素3水平試驗設計，試驗方案及結果見表3，回歸分析見表4~5。

表3試驗設計與結果

2.4.2 模型建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert 10.0.1軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，得到二次多項式回歸方程：

方差分析結果見表4~5。

表4酸度和pH值回歸方程的方差分析結果

(續(xù)表4)

表5感官評分回歸方程的方差分析結果

對回歸方程進行方差分析如表4~5所示。模型顯著性檢驗P＜0.05，失擬項不顯著，說明該模型具有統(tǒng)計學意義。從表4可以看出，工藝條件對酸度的影響大小順序為：A＞B＞C，即菌種接種量＞發(fā)酵時間＞復配穩(wěn)定劑添加量。模型的決定系數(shù)R2為0.9813，R2adj=0.9572，表明模型具有較高的擬合及預測精度；工藝條件對p H值影響大小順序為：B＞C＞A，即發(fā)酵時間＞復配穩(wěn)定劑添加量比例＞菌種接種量。模型的決定系數(shù)R2為0.9804，說明模型具有高的顯著性，而R2adj=0.9551，能夠解釋實驗95.51%的響應值變異，說明此實驗模型與真實數(shù)據(jù)擬合程度良好；同理，由表5可知，工藝條件對感官評分的影響大小順序為：C＞A＞B，即復配穩(wěn)定劑添加量比例＞菌種接種量＞發(fā)酵時間。模型的決定系數(shù)R2為0.9759，R2adj=0.9450，表明模型具有實踐指導意義。綜上，可以用上述模型來分析和預測p H值、酸度、感官評分的最優(yōu)工藝。

2.4.3 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

根據(jù)此回歸方程，通過響應面法得到最優(yōu)焦香型乳酸菌飲料工藝條件為取菌種接種量為0.18%、發(fā)酵時間為39.5 h、穩(wěn)定劑為大豆多糖B（B20170815）：復配增稠乳化劑（HBT-A7301），添加量為8%∶4%。此條件進行3次重復試驗，得平均p H值為3.73、平均酸度為104°T、平均感官評分89分，與模型預測結果吻合，表明基于該響應面模型分析優(yōu)化菌種接種量、發(fā)酵時間、復配穩(wěn)定劑添加量的方法有效可行。

2.5 焦香型乳酸菌飲料的產(chǎn)品質(zhì)量指標測定

由表6可知，制備的焦香型乳酸菌飲料沉淀率為5.527%，酸度為104°T，p H值為3.73，焦香型乳酸菌飲料呈現(xiàn)出沉淀率較低、組織細膩、質(zhì)地均勻的狀態(tài)，其中黏度直接影響焦香型乳酸菌飲料產(chǎn)品的口感[19]，黏度越低，口感越清爽，與李海燕[19]等研發(fā)的低糖褐色乳酸菌飲料（黏度為35 mPa·s）相比，本試驗黏度為33.4 mPa·s，說明本產(chǎn)品黏度更低一些，口感更為清爽。乳酸菌活菌數(shù)為1.0×107CFU/m L，大腸菌群、菌落總數(shù)、霉菌、酵母及致病菌未檢出，符合國家標準。與其他乳酸菌飲料相比，焦香型乳酸菌飲料酸含量高、更易消化、吸收，具有焦香味道且黏度低，口感更為清爽，賦予飲料特殊的香氣和口感。

表6焦香型乳酸菌飲料的理化特性

3 結論

基于美拉德反應制作出焦香型乳酸菌飲料，其美拉德工藝條件為100℃/90 min、葡萄糖添加量為20%，產(chǎn)品的褐色適中，焦香味顯著，風味獨特，符合消費者的要求。焦香型乳酸菌飲料加工的最佳發(fā)酵劑菌種為直投式FD-DVS ABY-8/25X 200U菌種，菌種接種量為0.18%、發(fā)酵時間為39.5 h、復配穩(wěn)定劑為大豆多糖（B20170815）：復配增稠乳化劑（HBT-A7301），其添加量為8%∶4%的條件下制得的焦香型乳酸菌飲料酸甜可口，顏色呈褐色，沉淀率為5.527%，黏度為33.4 mPa·s，酸度為104°T，p H值為3.73，乳酸菌活菌數(shù)為1.0×107CFU/mL，大腸菌群、菌落總數(shù)、霉菌、酵母及致病菌未檢出，開發(fā)的焦香型乳酸菌飲料是一款口感清爽，色澤風味濃郁的焦香型乳酸菌飲料，具有一定的市場前景，同時乳酸菌飲料產(chǎn)品的開發(fā)對乳酸菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展也具有一定的推動意義。