文│次仁拉姆（西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠）

小反芻獸疫（Peste des petits ruminants，PPRV）也稱作小反芻獸假性牛瘟、口炎腸肺炎綜合征等，是由小反芻獸疫病毒引起的烈性傳染病。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病主要感染對(duì)象為小反芻獸，以山羊最為常見?，F(xiàn)階段，并未發(fā)現(xiàn)感染人的病例。小反芻獸疫病毒和犬瘟熱病毒、牛瘟病毒、牛麻疹病毒、海豹瘟病毒等相類似，它們均屬于副粘病毒科麻疹病毒屬成員。該病最早發(fā)生于1942年，在非洲西部的象牙海岸首次暴發(fā)，隨后被命名稱作小反芻疫病。小反芻獸疫幾乎在全球范圍內(nèi)均有暴發(fā)，主要集中在亞洲和非洲的40多個(gè)國家。該病對(duì)畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重影響，尤其是山羊和綿羊等養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。在感染后，小反芻獸疫病毒通常對(duì)小反芻獸的上呼吸道淋巴樣組織、胃腸道有顯著的親和力，進(jìn)而出現(xiàn)病理性變化。此外，該病毒主要通過氣溶膠進(jìn)行傳播，從上呼吸道上皮組織入侵機(jī)體以后，迅速擴(kuò)散到全身部位，機(jī)體的排泄分泌物為主要的感染源。通常情況下，已被感染的動(dòng)物可通過分泌物與排泄物進(jìn)行排毒，近距離的接觸會(huì)感染其他動(dòng)物。在感染后的兩天時(shí)間內(nèi)，可以通過檢測(cè)動(dòng)物分泌物來進(jìn)行判斷。

調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，在干燥、低溫及存在風(fēng)沙的情況下，更容易出現(xiàn)細(xì)菌與小反芻獸疫的混合感染，并且在動(dòng)物感染以后，其胚胎和精液中就會(huì)出現(xiàn)病毒，該種病毒也會(huì)通過受精作用或者胚胎移植進(jìn)行傳播。因此，通常被感染的動(dòng)物在其潛伏期為主要的感染源。小反芻獸疫會(huì)對(duì)小反芻獸健康帶來嚴(yán)重危害，已被列入一類動(dòng)物疫病。針對(duì)小反芻疫病必須嚴(yán)加防范，及時(shí)采用有效措施進(jìn)行預(yù)防?；诖?，本研究通過對(duì)小反芻獸疫病毒在Vero細(xì)胞上的致細(xì)胞病變反應(yīng)予以分析，完成對(duì)接種毒液的小反芻獸疫病毒數(shù)據(jù)的測(cè)定，給疫苗生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1.設(shè)備儀器。二氧化碳培養(yǎng)箱:德國Hearcell生產(chǎn)；倒置顯微鏡：上海光密儀器有限公司；生物安全柜：上海力申科學(xué)儀器公司；細(xì)胞觀測(cè)臺(tái)；細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶機(jī)

2. 毒株選擇。原始毒株為clone9株，該毒株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

3.細(xì)胞選擇。在小反芻獸疫病毒培養(yǎng)應(yīng)用到的細(xì)胞為Vero傳代細(xì)胞，屬于非洲綠猴的腎細(xì)胞。（注：來源于生物藥品制造廠所保存的Vero細(xì)胞。）

4.細(xì)胞的復(fù)蘇。

（1）在進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇操作前半小時(shí)打開無菌室的A級(jí)潔凈度，對(duì)操作場(chǎng)所用苯酚5%消毒滅菌，并且用75%的酒精擦拭操作桌面。

（2）將凍存管迅速由液氮轉(zhuǎn)入到37℃水浴中（以防止-5℃二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞的損傷）凍存管的頂部保持在水面上，以避免任何的污染，還要不定時(shí)地?cái)嚢杓铀俳鈨觥?/p>

（3）當(dāng)細(xì)胞完全解凍后，用75%酒精擦拭凍存管，用離心機(jī)離心后，倒掉上清液，用營養(yǎng)液吹打使細(xì)胞完全分散，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到25平方厘米的克氏方瓶中，并加5%～8%的新生牛血清后在37℃溫室里培養(yǎng)。

5. 細(xì)胞傳代與接毒的操作步驟。

（1）在進(jìn)行細(xì)胞系傳代操作前對(duì)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所進(jìn)行消毒滅菌20分鐘，并點(diǎn)燃酒精燈，用75%酒精棉將手擦拭一遍。

（2）將EDTA-胰酶溶液放在37℃的恒溫水浴箱中預(yù)熱。

（3）將待傳代的細(xì)胞培養(yǎng)瓶用75%酒精擦拭一遍后放在操作臺(tái)上。

（4）將細(xì)胞瓶中原有的細(xì)胞生長(zhǎng)液倒入廢液缸中，在火焰的保護(hù)下用吸管向內(nèi)加入適量磷酸鹽緩沖液（PBS），以洗去細(xì)胞上存留的血清和營養(yǎng)液，然后倒掉PBS液。

（5）向細(xì)胞瓶加入適量的消化液即EDTA-胰酶溶液，輕輕搖動(dòng)細(xì)胞瓶，使細(xì)胞與消化液充分接觸，提高消化效率，然后水平放置在桌面上。

（6）當(dāng)細(xì)胞表面出現(xiàn)肉眼可見的毛玻璃樣，或出現(xiàn)針尖大小的縫隙時(shí)即可倒掉細(xì)胞消化液，平放在臺(tái)案上。

（7）待細(xì)胞面出現(xiàn)較大的裂痕時(shí)，細(xì)胞脫離瓶壁，此時(shí)細(xì)胞在胰酶的作用下仍繼續(xù)消化。

（8）用吸管向已消化好的細(xì)胞瓶中加入細(xì)胞生長(zhǎng)液（營養(yǎng)液）將細(xì)胞沖下并輕輕吹打以充分分散細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞停止消化。

（9）根據(jù)細(xì)胞密度，確定適宜分散率，根據(jù)分散率補(bǔ)足細(xì)胞生長(zhǎng)液，將細(xì)胞生長(zhǎng)液充分混勻，在酒精燈火焰保護(hù)下，均勻的分裝在細(xì)胞瓶中。

（10）將細(xì)胞瓶上注明傳代細(xì)胞的系名稱、日期等信息，在37℃的溫室中培養(yǎng)。 將溫度控制在37℃，在溫室培養(yǎng)48小時(shí)～72小時(shí)后，選擇生長(zhǎng)較好的Vero細(xì)胞單層，進(jìn)行接毒，對(duì)小反芻獸疫病毒毒種按照細(xì)胞生長(zhǎng)液的2%進(jìn)行接種，將其放置在37℃溫室進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)96小時(shí)～120小時(shí)，觀察小反芻獸疫病毒致細(xì)胞病變的情況、并按照病變情況進(jìn)行收毒。

6. 獲取病毒生長(zhǎng)相關(guān)數(shù)據(jù)。小反芻獸疫病毒的種毒clone9株，在經(jīng)過接種以后得到長(zhǎng)滿Vero細(xì)胞單層的瓶體，分別培養(yǎng)不同時(shí)間獲得相對(duì)應(yīng)的病毒（此次研究可按照24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)、144小時(shí)、168小時(shí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)）。每瓶細(xì)胞應(yīng)在規(guī)定觀察時(shí)間內(nèi)，按下述標(biāo)記錄病變程度。-:細(xì)胞正常。+：病變細(xì)胞約占25%。++：病變細(xì)胞約占50%。+++：病變細(xì)胞約占75%。#：病變細(xì)胞約占75%以上，或有脫落細(xì)胞。操作中需設(shè)置重復(fù)和陰性對(duì)照，經(jīng)過凍融3次處理以后，應(yīng)用病毒含量（TCID50）方法準(zhǔn)確測(cè)定毒價(jià)。

二、結(jié)果

1.觀察Vero細(xì)胞的病變過程。按照此次實(shí)驗(yàn)階段用于培養(yǎng)小反芻獸疫病毒使用的Vero傳代細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)獲得Vero細(xì)胞的病變過程，詳細(xì)情況見圖1。

◎圖1 生物藥品制造廠所保存的Vero細(xì)胞病變過程示意圖

2. 細(xì)胞接毒后病毒含量測(cè)定檢驗(yàn)，按照以下操作過程。

（1）在離心管中將病毒液10倍倍比稀釋處理，整個(gè)范圍控制在10-1～10-6。

（2）把稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度5個(gè)重復(fù)，各個(gè)孔接種量保持在100微升。

（3）在各個(gè)孔中加入對(duì)應(yīng)的細(xì)胞懸液，使細(xì)胞量控制在20萬～30萬/毫升。

（4）以正常細(xì)胞作為對(duì)照，培養(yǎng)144小時(shí)，期間每天觀察病變的變化情況，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

具體操作示意見圖2。

◎圖2 操作示意

三、結(jié)果分析

1.細(xì)胞病變過程。在對(duì)小反芻獸疫病毒進(jìn)行分離與培養(yǎng)期間，必須要有細(xì)胞培養(yǎng)物作為支持，此次研究過程采用Vero細(xì)胞。小反芻獸疫病毒感染后可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞使其成為合胞體，合胞體的核主要按照環(huán)狀進(jìn)行排列，擁有類似于表盤狀的外觀結(jié)構(gòu)。尤其是在羊的原代細(xì)胞培養(yǎng)物中，小反芻獸疫病毒展現(xiàn)出來的誘導(dǎo)過程更為顯著，特征結(jié)構(gòu)較明顯，總體上病變細(xì)胞呈圓形拉絲狀并具有折射力。

結(jié)合Vero細(xì)胞的細(xì)胞病變特征，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞病變初期，細(xì)胞間隙會(huì)變大，有少量的細(xì)胞堆積到一起形成團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，并且多個(gè)細(xì)胞在相互融合的條件下能夠呈現(xiàn)為多核狀態(tài)。而在細(xì)胞的中央部位存在團(tuán)狀的細(xì)胞質(zhì)，在其周圍擁有散射狀的折光環(huán)。同時(shí)，總體上細(xì)胞在64個(gè)小時(shí)左右就出現(xiàn)了合胞體，并且在細(xì)胞融合以后，其速度在加快、細(xì)胞融合的數(shù)量也在增多，最終變化為蜂窩狀的結(jié)構(gòu)。在此階段病變特征極其明顯，緊接著合胞體會(huì)逐漸連接成片狀，合胞體變大，附近出現(xiàn)較明亮的光環(huán)。細(xì)胞達(dá)到144個(gè)小時(shí)后，開始出現(xiàn)脫落的跡象，在此條件可把細(xì)胞進(jìn)行回收處理。

2.病毒生長(zhǎng)過程分析。觀察小反芻獸疫病毒的生長(zhǎng)情況，總體上在24個(gè)小時(shí)就進(jìn)入到增殖階段，并且在48到96小時(shí)期間增殖速度較快，后期增殖速度開始減緩，且在120個(gè)小時(shí)病毒含量接近較高水平，這也反映出小反芻獸疫病毒在Vero細(xì)胞中的增殖情況。

3.TCID50檢驗(yàn)結(jié)果。采用karber法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，按照lgTCID50＝L－d（s－0.5），其中L為最高稀釋度的對(duì)數(shù)，d為稀釋度對(duì)數(shù)之間的差值，s為陽性孔比率總和。最終檢測(cè)出將該病毒稀釋10-3.875接種100微升時(shí)可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。