李紅梅

(甘肅省天水市張家川縣動物疫病預防控制中心，甘肅 張家川 741500)

布魯氏菌病(brucellosis)，可簡稱“布病”，是由布魯氏菌屬(Brucella)的細菌侵入機體，引起的人獸共患的傳染變態(tài)反應性疾病，臨床上以長期發(fā)熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)疼痛，肝脾及淋巴結(jié)腫大為特點[1]，主要傳播途徑有：經(jīng)皮膚粘膜直接接觸感染，如獸醫(yī)、屠宰、飼養(yǎng)人員直接接觸病畜或病畜污染的水源、土壤、工具等。經(jīng)消化道感染：食用未經(jīng)高溫殺菌的病畜肉類，或被污染的水或其他食物，經(jīng)口腔、食道粘膜進入體內(nèi)；或經(jīng)呼吸道感染：在飼養(yǎng)放牧、皮毛加工等過程中接觸到被布魯氏菌污染的飛沫、塵埃等。布魯氏菌病雖然病死率不高，但會嚴重危害人民身體健康，導致因病致貧，同時會嚴重影響畜牧業(yè)的發(fā)展，更會帶來食品安全隱患。張家川縣畜牧業(yè)主要以發(fā)展牛羊養(yǎng)殖為主，活畜調(diào)運頻率高，動物疫病傳染風險較大，張家川縣被確定為布病防控三類地區(qū)，縣人民政府召開了專題會議，成立了布魯氏菌病防控工作領(lǐng)導小組，制定了《布魯氏菌病防控工作方案》，對全縣羊群全面開展布魯氏菌病排查和流行病學調(diào)查，檢測出陽性羊群，按照規(guī)定進行全群撲殺和無害化處理，同時對養(yǎng)殖圈舍等污染場地進行消毒，并落實撲殺補償機制。為了解張家川縣15個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的布魯氏菌病的流行情況，研究通過虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、PCR檢測法對2015—2020年采集的牛、羊血清樣品進行布魯氏菌病流行病學調(diào)查，旨在了解張家川縣布魯氏菌病流行情況，對近幾年布病防控成績進行科學評判，也為張家川縣牛羊布魯氏菌病的防控工作提供科學參考[2]。

1 材 料

1.1 血清樣品

2015—2020年隨機采集全縣1 245個場次的80 917份血清樣品，其中羊血清樣品70 992份，牛血清樣品9 925份。

1.2 檢測試劑

布虎紅平板凝集試驗抗原、標準陽性血清、標準陰性血清。血液基因組DNA提取試劑盒。

2 方 法

2.1 虎紅平板凝集試驗

2.1.1 器材及試劑 器材:清潔玻片、0.1 mL吸管、混合棒。試劑：虎紅平板凝集試驗抗原、標準陽性血清、標準陰性血清、待檢血清。

2.1.2 加 樣 按照《動物布魯菌病診斷技術(shù)》進行操作判定。首先用真空管采集待檢牛羊樣本并進行編號，待血清析出后，在玻璃板上標記待檢血清號，在玻片上加25 μL待檢血清，然后再滴加虎紅平板抗25 μL，充分混勻，在5 min內(nèi)觀察結(jié)果，每批次實驗設(shè)立陰性、陽性對照。為了確定診斷結(jié)果的準確性，采用試管凝集試驗對呈假陽性的樣品進行診斷，確保最終獲得診斷結(jié)果的準確性。

2.1.3 結(jié)果判定 玻片上出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象就判為陽性，液體均勻渾濁則判為陰性。

2.2 試管凝集試驗

2.2.1 器材及試劑 器材:1 mL、10 mL加樣器、玻璃試管、試管架、稀釋抗原用的潔凈容器、37 ℃培養(yǎng)箱。試劑：試管凝集抗原、被檢血清、生理鹽水。

2.2.2 配備稀釋液 用0.5%碳酸和10% NaCl配備檢測羊布魯氏菌病的稀釋液；用0.5%碳酸和0.9% NaCl配備檢測牛布魯氏菌病的稀釋液。

2.2.3 加 樣 第1管中首先加入920 μL稀釋液，再加入80 μL被檢血清；第2管中加入500 μL稀釋液，再加入500 μL第1管混合液；第3管中加入500 μL稀釋液，再加入500 μL第2管混合液；第4管中加入500 μL稀釋液，再加入500 μL第3管混合液；每管中再加入500 μL(1∶20)的試管凝集試驗抗原。將試管充分振蕩后，全部放于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，20 h后取出，在室溫放置1 h后觀察結(jié)果。

2.2.4 結(jié)果判定 為了判定準確，制備凝集反應標準比濁管作為判定透明程度的依據(jù)，其配制方法如下：取凝集反應稀釋的抗原液再作對倍稀釋，即5 mL稀釋抗原再加5 mL生理鹽水，混合后按表1方法配制。

表1 試管凝集反應標準比濁管配制

血清對照為清亮透明無沉淀抗原對照為均勾混濁。在兩種對照管都成立的情況下，才可判定試驗管，否則應重做?！?+++”液體完全透明，管底有傘狀凝集，有時會有卷邊，為100%凝集；“+++”液體近于完全透明，管底有傘狀凝集，為75%凝集；“++”液體略微透明，菌體呈較薄傘狀凝集，為50%凝集；“+”液體不透明，管底有不很明顯的凝集，為25%凝集；“-”液體不透明，無凝集現(xiàn)象。效價以產(chǎn)生50%凝集的(++凝集程度)血清最終稀釋倍數(shù)為受檢血清的效價。大型畜血清試驗的標準是凝集效價為1∶100++及以上為陽性；小型畜(羊)凝集效價為1∶50++及以上為陽性。張家川縣2015年至2020年實驗室牛、羊布魯氏菌病陽性檢出率分別為0.1%，1.89%。2015—2020年，張家川縣牛布魯氏菌病檢出率分別為0，0，0，0，0.08%，0.14%；羊布魯氏菌病檢出率分別為2.84%，2.63%，1.82%，1.64%，1.56%，1.32%；規(guī)模養(yǎng)殖場羊布魯氏菌病檢出率分別為8.62%，6.12%，4.96%，4.68%，4.24%，3.23%。檢測結(jié)果如表2、表3所示。

表2 2015—2020年羊、牛布魯氏菌病血清學檢測情況統(tǒng)計

表3 2015—2020年規(guī)模養(yǎng)羊場布魯氏菌病血清學檢測情況統(tǒng)計

3.2 PCR檢測法

3.2.1 器材及試劑 器材：無菌0.2 mL PCR管、10 μL、20 μL、200 μL的移液器及吸頭、PCR儀、電泳儀試劑：2*Taq PCR Master Mix、三蒸水、引物、瓊脂糖凝膠、待檢核酸、引物。

3.2.2 處理材料 使用200 μL血液，不足200 μL血液加入可加入緩沖液GA補足。共處理樣品7份，其中羊血清4份，牛血清3份，陽性對照1份，陰性對照1份。

3.2.3 實驗方法 提取DNA：樣品處理結(jié)束后，加入20 μL Proteinase溶液，混勻；再加入200 μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70 ℃放置10 min，溶液變亮，簡短離心去除管蓋內(nèi)壁的水珠；加入200 μL無水乙醇，充分振蕩混勻15 s，簡短離心去除管蓋內(nèi)壁的水珠；將上一步所得溶液和絮狀物都加入一個吸附柱CB3中，24 000 r/min 離心，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入500 μL緩沖液GD，24 000 r/min 離心，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW，24 000 r/min 離心，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中，并且重復操作1遍；將吸附柱CB3放回收集管中，6 000 r/min 離心，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，去除材料中多余的漂洗液；將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加200 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置5 min，6 000 r/min離心，將溶液收集到離心管中。

PCR擴增：引物序列見表4(根據(jù)BCSP31核酸序列設(shè)計的1對B1、B2引物對布魯氏菌進行核酸檢測)。

反應體系見表5。擴增參數(shù)：預變性93 ℃，5 min，變性93 ℃，1 min；退火60 ℃，1 min；延伸72 ℃，1 min，40個循環(huán)。最后延伸72 ℃，10 min。凝膠電泳：PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖上電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

表4 BCSP31聚合酶鏈式反應引物序列、產(chǎn)物長度

表5 聚合酶鏈式反應體系

結(jié)果(圖1)判定：陽性對照出現(xiàn)特異性條帶，陰性對照未出現(xiàn)條帶時實驗成立。樣本出現(xiàn)擴增目的片段長度為224 bp時，判為核酸檢測陽性。第一孔為Marker，第二孔為陽性對照，第三孔為陰性對照，1～4號樣品為羊血清，5～7號為牛血清，經(jīng)結(jié)果判定：1號、4號羊血清、5號、6號、7號牛血清全部為陽性。

圖1 凝膠電泳成像圖

3 討 論

從檢測結(jié)果可以得出，張家川縣持續(xù)存在羊布魯氏菌病的發(fā)生，主要發(fā)生在規(guī)模養(yǎng)殖場，自2015年至2020年規(guī)模養(yǎng)羊場陽性檢出率遞減，檢出感染牲畜主要是外地調(diào)入牲畜，說明在牲畜引進的過程中檢疫監(jiān)督工作漏洞很大。因為體制改革的原因，動物檢疫部門的官方獸醫(yī)被合并到農(nóng)業(yè)農(nóng)村局的執(zhí)法大隊，動物檢疫工作力度不夠，導致染疫牲畜流入。此外，牛群布魯氏菌病的檢出率較低，2019年的檢出率為0.08%，2020年的檢出率為0.14%。但是2020年比2019年有所增長，因為2019年、2020年精準扶貧工作的推進，國家對我縣畜牧養(yǎng)殖業(yè)進行大力扶持，許多養(yǎng)殖戶從外地大量購入牛，落地檢疫工作跟不上，導致大量布病牛引入，加之養(yǎng)殖戶對布病造成的危害、防治布病的知識了解甚少，致使購入或飼養(yǎng)患有布病的牛羊，成為布病的傳染源，為張家川縣的布病防控工作帶來難度。其次，張家川縣的養(yǎng)殖戶對母畜流產(chǎn)現(xiàn)象沒有科學的防范意識，接羔及畜產(chǎn)品加工時很少采取有效的防護措施，自我防護的意識淡薄，飼養(yǎng)時沒有做到生產(chǎn)區(qū)與生活區(qū)嚴格分離，致使患畜傳染給同群畜和人，這也是人感染布病的重要因素。第三，畜及畜產(chǎn)品的流通(特別是跨省、跨市、跨縣、跨鄉(xiāng)的流通)缺乏檢疫，由于活畜交易及畜產(chǎn)品的流通頻繁，經(jīng)營者有意逃避檢疫，販運戶通過各種途徑、從外地低價收購牛羊，也是布魯氏菌病傳播的重要途徑。

4 防 控

(1)政府應該制定有效控制布病的管理辦法，對飼養(yǎng)、屠宰、加工、經(jīng)營、倉儲、運輸?shù)壬a(chǎn)環(huán)節(jié)進行嚴格監(jiān)督管理，嚴格執(zhí)行牲畜檢疫，加強輸入牲畜的檢疫和管理，防止外地染疫牲畜及其產(chǎn)品流入，購進的健康易感動物必須出具布魯氏菌病檢測合格報告。牲畜調(diào)入后嚴格執(zhí)行落地報告和隔離觀察制度，隔離飼養(yǎng)30 d后縣經(jīng)動物衛(wèi)生監(jiān)督所檢疫合格后，方可混群入圈，正常飼養(yǎng)。落實動物檢疫申報、巡查、駐場等制度，實行"一對一"監(jiān)管責任制，限制高風險地區(qū)易感動物向低風險地區(qū)流動，嚴禁疫區(qū)動物向非疫區(qū)流動。

(2)對供奶場戶檢測布魯氏菌病合格后，發(fā)放《動物防疫合格證》后允許其經(jīng)營。對可疑病例應及時采樣，進行布魯氏菌病血清學檢測，血清學檢測陽性者應開展病原學檢測。調(diào)查發(fā)病畜群分布情況及畜群來源，養(yǎng)殖屠宰及交易場所情況，確定疫情發(fā)生可能的傳染源傳播方式以及疫情波及的范圍，追溯致病畜群的來源，對受威脅區(qū)的畜群實施隔離，對陽性布病牛羊及時淘汰撲殺，同時對撲殺的布病陽性牛羊的農(nóng)戶進行補償。

(3)畜牧養(yǎng)殖、皮毛販運從業(yè)人員在助產(chǎn)和處理流產(chǎn)胎兒、死胎時，應該做好個人防護，穿戴工作服、戴乳膠手套嚴格消毒，嚴禁赤手處理流產(chǎn)物。不隨意丟棄家畜的流產(chǎn)胎兒、胎盤等，對流產(chǎn)物及其物品要進行深埋、焚燒等無害化處理。被流產(chǎn)胎兒及其羊水污染的場地，用10%的漂白粉乳浸透墊草和地面，反復消毒2～3次。皮毛加工人員，工作前也要做好個人防護工作，對于來自布魯氏菌病疫區(qū)的皮毛要在收購地點進行消毒處理，包裝。養(yǎng)殖人員要養(yǎng)成良好的生活習慣，做到人畜分居，科學飼養(yǎng)各類家畜。定期開展畜牧養(yǎng)殖等高危人群的健康體檢，真正做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，減少人感染布病的幾率，保障人民身體健康[4]。

(4)定期開展流行病學調(diào)查和血清學抽樣檢測工作，加大布魯氏菌病監(jiān)測的覆蓋面，對布病流行趨勢進行評估，為布病防控工作制定科學防治方案[5]。

(5)盡早落實從事畜牧獸醫(yī)人員的衛(wèi)生津貼待遇，調(diào)動機關(guān)單位、養(yǎng)殖企業(yè)、個人及社會力量的參與，形成群防群控的良好局面。