徐菁，李杰，劉曉燕，2*

（1.貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院貴州 貴陽(yáng) 550005；2.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550005）

黃姜為姜科（Zingiberaceae）姜屬（Zingiber）植物姜（Zingiber officinale Roscoe）的塊莖[1]，又名小種姜，有利膽、健胃止嘔、消水腫的作用，與蜂蜜合用對(duì)肝病恢復(fù)有益[2]。姜油是生姜的提取物，其揮發(fā)性成分為生姜的主要風(fēng)味物質(zhì)，在醫(yī)藥和食品方面具有廣泛的應(yīng)用空間。

目前姜油提取方式主要有水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法、超臨界二氧化碳提取法、超聲波法、壓榨法等[3-4]。鑒于不同提取方式對(duì)姜油的揮發(fā)性成分影響不同，本研究采用現(xiàn)代提取方法（超臨界二氧化碳提取法）和傳統(tǒng)提取法（水蒸氣蒸餾法和溶劑提取法）3種方法提取黃姜姜油，采用高效、快速的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrum association，GCMS）作為檢測(cè)姜油揮發(fā)性成分的方法，運(yùn)用主成分和聚類(lèi)分析對(duì)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析、比較，旨在進(jìn)一步全面了解黃姜姜油中的揮發(fā)性成分，探討研究能較完整保留姜油揮發(fā)性成分的提取方法，并通過(guò)ABTS+自由基、DPPH自由基和羥基自由基清除試驗(yàn)證明其抗氧化活性，旨在為其生物活性的進(jìn)一步研究提供試驗(yàn)依據(jù)，對(duì)指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生姜樣品：現(xiàn)采新鮮貴州省安順市鎮(zhèn)寧縣黃姜，清洗干凈后切片置于50℃烘箱中烘干，打碎，過(guò)60目篩后密封保存?zhèn)溆谩?/p>

石油醚、無(wú)水乙醇：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；活性白土植物油脫色澄清劑：樂(lè)平市元昶膨潤(rùn)土有限公司；30%過(guò)氧化氫、七水合硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；水楊酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；2，2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：上海麥克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：北京瑞泰科技有限公司；抗壞血酸（純度≥99.7%）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

循環(huán)水真空泵（SHB-III）：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；智能高低溫循環(huán)水器（FCL6-20）：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；電熱恒溫干燥箱（202-1AB）：天津市泰斯特儀器有限公司；多功能粉碎機(jī)（CS-2000）：永康市天祺盛世國(guó)貿(mào)有限公司；電子天平（DJ-A500）：福州華志科學(xué)儀器有限公司；紫外分光光度儀（UV-2550）：日本島津公司；超臨界萃取裝置（HA420-50-06）：南通市華安超臨界萃取實(shí)業(yè)公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS（9000-7000D）：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 姜油的提取

1.3.1.1 水蒸氣蒸餾法

稱(chēng)取50g姜粉按照料液比1∶10（g/mL）加入500mL蒸餾水，浸泡2 h，于蒸餾裝置中提取7 h[5]。提取液倒入分液漏斗，取上層油狀物，以活性白土植物油脫色澄清劑為除色劑，在25℃下進(jìn)行除色，循環(huán)水真空泵進(jìn)行抽濾，姜油置于避光玻璃器皿內(nèi)。提取率計(jì)算公式如下[6]。

式中：X為姜油提取率，%；m為姜油質(zhì)量，g；M為姜原料質(zhì)量，g。

1.3.1.2 溶劑提取法

稱(chēng)取50g姜粉按照料液比1∶10（g/mL）加入500mL的石油醚，于索氏提取器內(nèi)60℃回流提取，至索氏提取器內(nèi)液體澄清透明或圓底燒瓶?jī)?nèi)油液混合物不再減少為止[7]，提取液進(jìn)行旋蒸，去除提取液中多余的石油醚和水，以活性白土植物油脫色澄清劑為除色劑，在25℃下進(jìn)行除色，循環(huán)水真空泵進(jìn)行抽濾，收集揮發(fā)油并稱(chēng)重，提取率計(jì)算同水蒸氣蒸餾法。

1.3.1.3 超臨界二氧化碳提取法

稱(chēng)取50 g姜粉放入超臨界萃取裝置中，25 MPa、40℃萃取條件下萃取3h，提取率計(jì)算同水蒸氣蒸餾法。

1.3.2 GC-MS檢測(cè)

色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣：高純He 0.8 mL/min；柱箱溫度：75℃保持1 min；5℃～150℃，2℃/min；150℃～280℃，5℃/min，保持 5 min。進(jìn)樣方式：進(jìn)樣口 260 ℃；分流比 100∶1，進(jìn)樣 1 μL。質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃；MS傳輸線(xiàn)260℃；掃描范圍10 amu～800 amu。

1.3.3 姜油抗氧化活性研究

參考楊事維[8]方法，稍作改動(dòng)。在具塞刻度試管中加入不同質(zhì)量濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL）姜油溶液1 mL，依次加入2 mL FeSO4（6.0 mmol/L）溶液、3 mL水楊酸-乙醇溶液（9.0 mmol/L），再加入2 mL H2O2（9.0 mmol/L）溶液，搖勻，此時(shí)將試管移入37℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后，以無(wú)水乙醇作為調(diào)零液，在510 nm處測(cè)定其吸光度，即為A1，在相同條件下，以純水代替H2O2，在510 nm處測(cè)定其吸光度，為A2?？瞻捉M以無(wú)水乙醇代替樣品，在510 nm處測(cè)定其吸光度，即為A0，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，按下列公式計(jì)算羥基自由基清除率。

式中：A0為樣品空白組（FeSO4+水楊酸-乙醇溶液+H2O2+無(wú)水乙醇）；A1為樣品組吸光度（樣品+FeSO4+水楊酸-乙醇溶液+H2O2）；A2為樣品對(duì)照組吸光度（樣品+FeSO4+水楊酸-乙醇溶液+純水）。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考陸占國(guó)等[9]的方法，稍作改動(dòng)。DPPH配制成1.0×10-4mol/L DPPH-乙醇溶液，用95%乙醇分別配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12mg/mL 姜油溶液。分別取2.0 mL樣品液和2.0 mL的DPPH溶液（1 mmol/L）混合均勻，暗處放置0.5 h，以95%乙醇作參照，測(cè)定吸光度A；2.0 mL樣品液與2.0 mL 95%乙醇混合后測(cè)定吸光度A0；2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL無(wú)水乙醇混合液測(cè)定吸光度A1。以上吸光度均在517 nm測(cè)定，清除率計(jì)算公式如下。

1.3.3.3 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定

參照段斌等[10]的方法，稍作改動(dòng)。將ABTS溶液（7 mmol/L）和 K2S2O8溶液（2.45 mmol/L）等體積混合，并搖勻，陰暗放置13 h～16 h，將ABTS溶液用95%乙醇溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)敝廖舛葹?.70±0.02。取0.2 mL姜油，加入3.8 mL ABTS溶液，在吸光度為734 nm下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定吸光度A，測(cè)定ABTS溶液的吸光度A0，清除率計(jì)算公式如下。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析

以GC-MS鑒定出的3種提取方法中各個(gè)化學(xué)成分的峰面積為指標(biāo)，用SPSS 26.0軟件對(duì)3種提取方法所鑒定出所有化合物進(jìn)行主成分分析和聚類(lèi)分析。

卷包車(chē)間和咀棒車(chē)間是煙草企業(yè)的最關(guān)鍵生產(chǎn)環(huán)節(jié)，需要對(duì)其生產(chǎn)流程進(jìn)行詳細(xì)的調(diào)研，將生產(chǎn)的全過(guò)程進(jìn)行控制。保證生產(chǎn)的順利進(jìn)行，提高生產(chǎn)效率以及產(chǎn)品質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法下姜油的揮發(fā)性成分

3種方法所得姜油的提取率以及分離鑒定的化合物數(shù)見(jiàn)表1。

表1 3種提取方法姜油提取率以及化合物數(shù)比較Table 1 Comparison of yield and compound number of ginger oil by three extraction methods

由表1可以得出，超臨界二氧化碳提取法的提取率要高于水蒸氣蒸餾法和溶劑法，經(jīng)GC-MS分析所得3種提取方法的總離子色譜圖分別見(jiàn)圖1、圖2和圖3。

圖1 超臨界二氧化碳提取姜油總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of ginger oil extracted by supercritical carbon dioxide

圖2 水蒸氣蒸餾法提取姜油總離子流色譜圖Fig.2 Total ion flow chromatogram of ginger oil extracted by steam distillation

圖3 水蒸氣蒸餾法提取姜油總離子流色譜圖Fig.3 Total ion flow chromatogram of ginger oil extracted by steam distillation

由圖1、圖2和圖3可知，超臨界二氧化碳提取法共鑒定出48種化合物，水蒸氣蒸餾法共鑒定出39種化合物，溶劑提取法共鑒定出45種化合物。采用面積歸一法測(cè)定3種提取方式所得姜油揮發(fā)性成分各組分相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同提取方式下姜油揮發(fā)性成分相對(duì)含量Table 2 Relative content of volatile components in ginger oil under different extraction

續(xù)表2 不同提取方式下姜油揮發(fā)性成分相對(duì)含量Continue table 2 Relative content of volatile components in ginger oil under different extraction

參考吳林芬等[11]的分析方法，比較分析表1和表2中3種不同提取方法提取的姜油揮發(fā)性組分在成分和含量上都存在一部分差異，其中超臨界二氧化碳提取法較小，水蒸氣蒸餾法和溶劑提取法的差異較大，表明這3種不同提取方法對(duì)姜油的提取效果是不一樣的。在超臨界二氧化碳提取姜油的提取物中，含量較高的揮發(fā)性化合物主要是萜烯類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)和酯類(lèi)化合物；在水蒸氣蒸餾法提取姜油的提取物中，含量較高的揮發(fā)性化合物主要是萜烯類(lèi)、脂類(lèi)、醇類(lèi)和酮類(lèi)化合物；溶劑萃取法提取姜油的提取物中，含量較高的化合物主要是萜烯類(lèi)、脂類(lèi)、醇類(lèi)和酮類(lèi)化合物。3種提取方法的組成基本相同，但組分之間的相對(duì)含量存在差異，水蒸氣蒸餾法提取的少量化合物損失較大，且部分全部損失。比較3種提取方式的數(shù)據(jù)可以看出，3種提取方法鑒定物質(zhì)中有38種是共有的，其中超臨界二氧化碳提取的姜油揮發(fā)性成分相對(duì)于其他兩種方式提取的揮發(fā)性成分保留的較完整，因萜烯組分對(duì)姜的風(fēng)味特征貢獻(xiàn)較大[12]，從物質(zhì)的組成而言，超臨界二氧化碳提取保留了姜原有的辛辣風(fēng)味[13]。

2.2 主成分分析（principal components analysis，PCA）

對(duì)GC-MS所鑒定的共有38種化合物進(jìn)行編號(hào)（1～38）后，采用SPSS 26.0進(jìn)行主成分分析，以共有化合物的峰面積為指標(biāo)進(jìn)行分析，分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 特征值與貢獻(xiàn)值Table 3 Eigenvalue and contribution rate

根據(jù)特征值大于1的原則[14-15]，由表3可知，共分析得兩個(gè)主成分，貢獻(xiàn)率分別為94.269%和5.731%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)100%。故前兩個(gè)主成分能很好地代表38種姜油揮發(fā)性成分的信息，因此選取前兩個(gè)主成分繼續(xù)后續(xù)的成分分析。主成分因子的特征向量與載荷矩陣見(jiàn)表4。

表4 主成分因子的特征向量與載荷矩陣Table 4 Eigenvectors and load matrices of principal component factors

由表4可知，主成分1中部分化合物載荷量相同，反映的指標(biāo)與芳樟醇、松油醇、反式-2-辛烯-1-醇、香葉醇、羥基香茅醇、橙花醇乙酸酯、β-蓽澄茄烯、依蘭烯、可巴烯、γ-萜品烯、α-萜品烯、7-表-α-己烯呈高度正相關(guān)，與β-環(huán)檸檬醛、姜酮、癸醛呈高度負(fù)相關(guān)，對(duì)主成分1貢獻(xiàn)最大的是松油醇、香葉醇、羥基香茅醇、β-蓽澄茄烯、橙花醇乙酸酯，它們的載荷量都為1.000，對(duì)主成分1貢獻(xiàn)最小的是姜酮，載荷量為-0.993；主成分2反映的主要指標(biāo)與α-蒎烯、γ-蓽橙茄烯，與α-蒎烯、γ-蓽橙茄烯、γ-衣蘭油烯、莰烯呈正高度相關(guān)，與欖香烯和辛醛等呈負(fù)相關(guān)，主成分2貢獻(xiàn)最大的是γ-蓽橙茄烯，載荷量為0.997，載荷量最小的是辛醛，載荷量為-0.192。綜合上述分析姜油中重要揮發(fā)性物質(zhì)有松油醇、香葉醇、羥基香茅醇、β-蓽澄茄烯、橙花醇乙酸酯、γ-蓽橙茄烯，可以歸結(jié)為醇類(lèi)物質(zhì)、烯類(lèi)物質(zhì)以及其他物質(zhì)等，可以用這幾項(xiàng)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)黃姜姜油揮發(fā)性成分的組成。

2.3 聚類(lèi)分析

以3種提取方法所鑒定出共有38種化合物的峰面積為指標(biāo)，采用SPSS 26.0進(jìn)行組間聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同提取方法提取姜油鑒定的揮發(fā)性成分聚類(lèi)圖Fig.4 Cluster diagram of volatile components identified by different extraction methods of ginger oil

參考文獻(xiàn)中[16-18]的分析方法，根據(jù)主成分分析結(jié)果，以38種化合物為指標(biāo)劃分距離，當(dāng)距離為5時(shí)，38種化合物被聚為2類(lèi)，姜烯為一類(lèi)，其余37種化合物聚為一類(lèi)。雖然聚類(lèi)分析分類(lèi)與主成分分析分類(lèi)結(jié)果一致，但也存在一定的差異，說(shuō)明不同提取方法對(duì)姜油揮發(fā)性成分存在影響。

2.4 超臨界二氧化碳法提取的姜油抗氧化活性分析

2.4.1 超臨界二氧化碳法提取的姜油對(duì)DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基是一種穩(wěn)定性高，并且可以長(zhǎng)時(shí)間保存的自由基，經(jīng)常被用作測(cè)試抗氧化性的試劑[19]。姜油對(duì)DPPH自由基的清除能力見(jiàn)圖5。

圖5 姜油對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.5 Scavenging effect of ginger oil on DPPH free radical

由圖5可知，對(duì)照組VC和姜油均對(duì)DPPH自由基表現(xiàn)出了清除能力。姜油對(duì)DPPH自由基清除率與濃度存在著一定的正相關(guān)性，且清除率上升明顯，當(dāng)濃度超過(guò)0.08 mg/mL時(shí)，清除率的上升趨勢(shì)有所減緩。VC在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，清除率均在90%以上，總體來(lái)說(shuō)，超臨界二氧化碳法提取的姜油對(duì)DPPH自由基具有良好的清除能力。

2.4.2 超臨界二氧化碳法提取的姜油對(duì)ABTS+自由基的清除能力

ABTS法是使用最普遍的測(cè)量抗氧化劑抗氧化的比色法[20]。超臨界二氧化碳法提取的姜油對(duì)ABTS+自由基的清除能力見(jiàn)圖6。

圖6 姜油對(duì)ABTS+自由基清除能力Fig.6 Scavenging effect of ginger oil on ABTS+free radical

由圖6可知，對(duì)照組VC和姜油對(duì)ABTS+自由基均具備清除能力。當(dāng)VC濃度低于0.06 mg/mL時(shí)，其ABTS+自由基清除率隨著濃度的升高逐漸增大，且各個(gè)濃度的清除率上升變化明顯，當(dāng)濃度為0.06 mg/mL時(shí)，自由基清除率達(dá)到了88.85%，之后隨著濃度的提高，自由基清除水平處于平衡。姜油對(duì)ABTS+自由基的清除率，隨著濃度的升高而增大，最大濃度的清除率達(dá)到71.04%。總體來(lái)說(shuō)，超臨界二氧化碳法提取的姜油對(duì)ABTS+自由基具有良好的清除能力。

2.4.3 超臨界二氧化碳法提取的姜油對(duì)羥基自由基的清除能力

超臨界二氧化碳法提取的姜油對(duì)羥基自由基的清除能力見(jiàn)圖7。

圖7 姜油對(duì)羥基自由基清除能力Fig.7 Scavenging effect of ginger oil on hydroxyl radical

由圖7可知，姜油在較低濃度下對(duì)羥基自由基的清除效率較低，隨著濃度的增加清除率逐漸升高[21]，在濃度為0.12 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到最大值29.62%，在試驗(yàn)劑量濃度范圍內(nèi)，VC清除羥基自由基的效果明顯高于姜油對(duì)羥基自由基的清除效果[22]?？傮w來(lái)說(shuō)，超臨界二氧化碳法提取的姜油對(duì)羥基自由基具有較好的清除能力。

3 結(jié)論

采用超臨界二氧化碳提取、溶劑法和水蒸氣蒸餾法3種不同提取方法，以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為檢測(cè)方法結(jié)合計(jì)算機(jī)軟件Masshunter和譜庫(kù)NIST MS Search 2.2進(jìn)行對(duì)比分析。其中，超臨界二氧化碳提取法提取率為4.80%，共鑒定出48種化合物；水蒸氣蒸餾法提取率為2.12%，共鑒定出39種化合物；溶劑法提取率為3.95%，共鑒定出45種化合物。3種提取方法所鑒定出的化合物組成基本相同，但組分之間存在明顯差異，其中姜酚類(lèi)含量因水蒸氣提取及溶劑法皆需高溫加熱，所以姜酚類(lèi)含量皆比超臨界二氧化碳低。超臨界二氧化碳提取的具有揮發(fā)性成分相對(duì)于另兩種，揮發(fā)性成分保留的較完整。對(duì)GC-MS所鑒定的3種姜油中共有的38種化合物進(jìn)行主成分分析，可分為2個(gè)主成分，黃姜姜油的主要揮發(fā)性物質(zhì)可以歸結(jié)為醇類(lèi)物質(zhì)、烯類(lèi)物質(zhì)以及其他物質(zhì)等，可以用這幾項(xiàng)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)黃姜姜油揮發(fā)性成分的組成。在聚類(lèi)分析時(shí)將化合物聚類(lèi)為2類(lèi)是具有可行性的，姜烯為一類(lèi)，其余37種化合物為一類(lèi)，雖然分析結(jié)果與主成分分析的結(jié)果存在一定的差異，但仍可說(shuō)明不同提取方法對(duì)姜油揮發(fā)性成分存在影響。在原料相同的情況下，超臨界二氧化碳是提取黃姜姜油的最佳方法，并對(duì)其提取的姜油進(jìn)行抗氧化活性研究，研究結(jié)果表明，對(duì)ABTS+自由基、DPPH自由基和羥基自由基3種自由基均有較好的清除效果。綜上分析得出，超臨界二氧化碳提取法提取的姜油的品質(zhì)相對(duì)較好。