楊燕敏，鄭振佳，李桂芹，張仁堂*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018；2.濱州職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，山東 濱州 256603）

紅棗又稱大棗，原產(chǎn)于中國，是鼠李科植物棗的成熟果實(shí)[1]。紅棗作為一種食藥同源產(chǎn)品[2]，含有多酚類物質(zhì)、五環(huán)三萜類化合物、黃酮、活性多糖和環(huán)磷酸腺苷等多種生物活性物質(zhì)。因此，具有免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝、補(bǔ)血、抗衰老和抗癌等功效，在人體保健和疾病防治方面發(fā)揮重要作用[3]。

多糖大量存在于動(dòng)物、植物以及微生物中，由于其優(yōu)良的生物活性，在食品和醫(yī)藥行業(yè)廣泛應(yīng)用。天然多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，結(jié)構(gòu)類型明顯多于蛋白質(zhì)，但是多糖復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和各種生物活性機(jī)制導(dǎo)致其在醫(yī)藥和食品添加劑領(lǐng)域的應(yīng)用存在許多缺陷。當(dāng)前，通過對多糖改性進(jìn)行分子修飾的方法，不僅可以獲得不同結(jié)構(gòu)類型的多糖衍生物，而且有可能改變多糖的理化特性及生物功能，是發(fā)現(xiàn)和研制新型多糖類藥物的重要途徑[4]。目前已有報(bào)道的多糖改性化學(xué)方法有羧甲基化[5]、磷酸化[6]、硫酸酯化[7]、乙?；痆8]和硒化[9]等，通過對多糖進(jìn)行分子修飾，不僅使多糖結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，還可以增強(qiáng)功能活性。焦中髙[10]研究了紅棗多糖的硫酸酯化修飾、羧甲基修飾、乙?；揎椀睦砘匦砸约翱寡趸⒔笛堑壬锘钚?，結(jié)果表明改性修飾后的多糖均可改善其在水溶液中的分布狀態(tài)，提高其溶解性。對紅棗多糖適度硫酸酯化修飾可以增強(qiáng)其對超氧陰離子自由基的清除活性；對紅棗多糖羧甲基化修飾和乙?；揎椏娠@著提高其羥基自由基清除活性，不同取代基修飾均降低了紅棗多糖對α淀粉酶的抑制活性，但可增強(qiáng)其對α葡萄糖苷酶的抑制活性，其中尤以羧甲基化修飾的效果最好。

本文通過對哈密大棗多糖進(jìn)行硫酸改性、羧甲基改性和硒化改性，研究其改性前后結(jié)構(gòu)變化，為進(jìn)一步研究紅棗多糖改性后功能活性和應(yīng)用途徑提供理論參考，為紅棗多糖的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗：新疆哈密大棗，市售。

濃硫酸（優(yōu)級純）、苯酚、葡萄糖、無水乙醇、石油醚（均為分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；正丁醇（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250（均為分析純）：上海奧博生物科技有限公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、Dextranstandards 1152標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；多糖分子量測定標(biāo)品（5 000、11 600、23 800、48 600、80 900、148 000、273 000、409 800、667 800 Da）：美國西格瑪奧德里奇公司。

1.2 儀器與設(shè)備

754N紫外可見分光光度計(jì)：上海奧普勒儀器有限公司；1836型烏氏黏度計(jì)：臺州市椒江玻璃儀器廠；UV-2450紫外可見分光光度計(jì)、LC-10A高效液相色譜儀：日本島津公司；KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；ThermoFisherICS-5000+高效陰離子交換色譜儀、Nicole iS10型紅外光譜儀：美國Thermo Fisher科技公司；ZEISS-SUPRATM 55型掃描電子顯微鏡：德國卡爾蔡司公司；SCIENTZ-12N冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的制備

1.3.1.1 紅棗多糖的提取純化

將紅棗去核切片，置于60℃烘箱中干燥，粉碎后過40目篩網(wǎng)，加入蒸餾水使料液比為1∶10（g/mL）進(jìn)行回流提取。100℃煮沸后浸提45 min，浸提2次，合并多糖提取液，濃縮后醇沉，冷凍干燥后備用[11]。用石油醚和粗多糖溶液按1∶1體積比充分混勻，用分液漏斗分離脫脂，重復(fù)3次。將粗多糖溶液和Sevag試劑（氯仿和正丁醇體積比4∶1）按4∶1體積比加入，強(qiáng)烈振蕩，靜置分層后離心棄去下清液及中間夾雜的變性蛋白[12]，重復(fù)7次，通過透析去除小分子雜質(zhì)，濃縮后凍干得純化多糖，將其命名為紅棗多糖，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.1.2 紅棗多糖的羧甲基化改性

取1.0g多糖在劇烈攪拌下懸浮于40mL異丙醇中30min，再加入3 mol/L的NaOH 20 mL，20℃攪拌1 h，加入2.5 g氯乙酸在60℃下反應(yīng)4 h，冷卻至20℃，用3 mol/L HCl中和，透析醇沉凍干得羧甲基化紅棗多糖[13]。采用酸堿滴定法測定羧甲基化多糖的取代度[14]。

1.3.1.3 紅棗多糖的硫酸法改性

將30 mL濃硫酸和10 mL正丁醇按3∶1體積比在冰水浴下混合，加入 125 mg（NH4）SO4，使溶液冷卻至0℃以下，加入1.0 g多糖，攪拌30 min，加入3 mol/L NaOH，調(diào)pH值為7，醇沉后透析，凍干得硫酸化紅棗多糖[15]。采用硫酸鋇濁度法測樣品中硫的含量，在360nm波長下，用K2SO4建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。

1.3.1.4 紅棗多糖的硒化改性

取1.0g多糖放入250mL三角燒瓶中，加入100mL 0.5%硝酸溶液，水浴加熱到70℃，加入0.8 g Na2SeO3和1.44 g BaCl2，70℃水浴6 h，冷卻至室溫25℃，過濾去沉淀，用無水碳酸鈉調(diào)pH值為7。加1.4 g Na2SO4，離心取上清后透析，取透析上清加抗壞血酸，若變紅，則繼續(xù)透析，顏色不變則透析結(jié)束，凍干得硒化紅棗多糖[17]。用紫外分光光度法測定硒元素含量[18]。

1.3.2 多糖含量和蛋白質(zhì)含量測定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚硫酸法[19]測定多糖含量。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法[20]測定多糖中蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 光譜分析

1.3.3.1 紫外光譜分析

配制濃度為1 mg/mL多糖溶液，置于石英比色皿，在190 nm～400 nm波段下進(jìn)行掃描，觀察在260 nm處有無核酸吸收峰和280 nm有無蛋白質(zhì)吸收峰，以檢測雜質(zhì)是否去除干凈[21]。

1.3.3.2 紅外光譜分析

將多糖樣品粉末均勻附著于樣品臺上，使用傅立葉紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）在4 000 cm-1～400 cm-1范圍內(nèi)掃描，并使用OMNIC軟件分析結(jié)果[22]。

1.3.4 單糖組成分析

通過高效陰離子交換色譜儀分析4個(gè)樣品的單糖組成，準(zhǔn)確稱取10 mg的多糖，在80℃下用4 mL 2.0 mol/L三氟乙酸水解6 h，去除殘留的三氯乙酸，用超純水定容至10 mL，并通過Supelclean ENVI-18固相萃取管和0.22 μm超濾管澄清。在30℃下以NaOH（0.20 moL/L）溶液作為流動(dòng)相以0.25 mL/min的流速分析樣品。

1.3.5 分子量的測定

精密稱取樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，樣品配制成5 mg/mL溶液，12 000 r/min離心10 min，上清液用 0.22 μm的微孔濾膜過濾，然后將樣品轉(zhuǎn)置于1.8 mL進(jìn)樣小瓶中。色譜柱：BRT105-104-102串聯(lián)凝膠柱（8 mm×300 mm）；流動(dòng)相：0.05 mol/LNaCl溶液；流速：0.6 mL/min，柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測器：示差檢測器 RI-502。

1.3.6 多糖樣品的表面特征分析

利用ZEISS-SUPRATM55型掃描電子顯微鏡觀察多糖樣品的表面形態(tài)。將多糖樣品粉末均勻附著于樣品臺上，置于離子濺射儀中進(jìn)行真空鍍金，在高真空條件下掃描樣品。

1.3.7 相對黏度測定

配制1 mg/mL多糖溶液，整個(gè)試驗(yàn)流程將烏氏黏度計(jì)放在（25±0.5）℃條件下，將多糖溶液倒入烏氏黏度計(jì)中恒溫15 min，測定多糖溶液從烏氏黏度計(jì)上刻度線流到下刻度線所需時(shí)間T1，以去離子水做對照，相同條件下所需時(shí)間T，T1/T即為多糖溶液在25℃條件下為濃度1 mg/mL的相對黏度[18]。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin2017進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅棗多糖改性前后的理化性質(zhì)分析

紅棗多糖改性衍生物取代度、得率及化學(xué)成分見表1。

表1 紅棗多糖改性衍生物取代度、得率及化學(xué)成分Table 1 Substitution degree，yield and chemical composition of jujube polysaccharide modified derivatives

由表1可知，硫酸化紅棗多糖取代度較高，為1.65，但得率較低，為59.15%。羧甲基化紅棗多糖取代度較低，為0.42，但是得率最高，為91.1%。硒化紅棗多糖得率為 68.8%，硒元素含量為（580.15±11.96）μg/g。紅棗多糖中蛋白質(zhì)含量最高，為1.49%，多糖含量也最高，為49.96%。而羧甲基化紅棗多糖、硫酸化紅棗多糖和硒化紅棗多糖的多糖含量和蛋白質(zhì)含量均有所降低，這可能是由于改性時(shí)酸性環(huán)境引起多糖和蛋白質(zhì)降解以及新官能團(tuán)引入，與童微等[23]的研究結(jié)果一致。紅棗多糖的分子量為136 413 Da，羧甲基化紅棗多糖的重均分子量為46 637 Da，硒化紅棗多糖的重均分子量為136 153 Da，而硫酸化紅棗多糖為兩個(gè)洗脫峰，重均分子量分別為9 970 Da和6 149 Da。改性后多糖分子量均有所減小，硒化紅棗多糖改性后分子量和改性前相差不大，硫酸化紅棗多糖改性后分子量和改性前相差最大，表明硫酸改性時(shí)多糖發(fā)生了強(qiáng)烈降解。

2.2 光譜分析

2.2.1 紫外全波長掃描

紅棗多糖的紫外掃描圖譜見圖1。

圖1 紅棗多糖的紫外掃描圖譜Fig.1 UV spectrum of jujube polysaccharide

如圖1所示，紅棗多糖在280nm處有明顯吸收峰，說明含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)，其他多糖組分280 nm處沒有明顯多糖吸收峰，說明蛋白質(zhì)含量少，結(jié)果和蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果一致。

2.2.2 紅外光譜

紅棗多糖的紅外圖譜見圖2～圖5。

圖2 紅棗多糖的紅外圖譜Fig.2 FT-IR spectrum of jujube polysaccharide

圖3 羧甲基化紅棗多糖的紅外圖譜Fig.3 FT-IR spectrum of carboxymethylated jujube polysaccharide

圖4 硫酸化紅棗多糖的紅外圖譜Fig.4 FT-IR spectrum of sulfated jujube polysaccharide

圖5 硒化紅棗多糖的紅外圖譜Fig.5 FT-IR spectrum of selenized jujube polysaccharide

由圖2～圖5可知，改性前后的多糖紅外光譜在3 265.75 cm-1～3 382.72 cm-1范圍內(nèi)均有強(qiáng)吸收峰，是多糖分子間或分子內(nèi)的O-H的伸縮振動(dòng)引起的；在2 935.20 cm-1～2 958.83 cm-1均出現(xiàn)了弱吸收峰，是糖類不對稱C-H伸縮振動(dòng)。羧甲基化紅棗多糖在1 640 cm-1處的信號為C=O的非對稱伸縮振動(dòng)，1 420 cm-1處的信號為次甲基的伸縮振動(dòng)，這兩個(gè)吸收峰附近是羧甲基的特征吸收峰，與紅棗多糖紅外光譜相比明顯增強(qiáng)，說明發(fā)生了羧甲基化反應(yīng)[24]，各硫酸衍生物中均有硫酸根的特異吸收峰。硫酸化紅棗多糖在1 212.46 cm-1處的信號為S=O的非對稱伸縮振動(dòng)，和紅棗多糖紅外光譜相比明顯加寬，對應(yīng)于酯硫酸鹽基團(tuán)，825.09 cm-1處的峰值，對應(yīng)于C-O-S對稱性拉伸振動(dòng)[25]。將硒化紅棗多糖與紅棗多糖紅外光譜進(jìn)行比較，硒化紅棗多糖在1 416.89 cm-1吸收峰增大，為糖環(huán)上與Se=O相鄰的C-H特征吸收峰[26]。

2.3 單糖組成

單糖組成分析結(jié)果見表2。

表2 單糖組成分析結(jié)果Table 2 Analysis results of monosaccharide composition%

由表2可知，紅棗多糖主要由阿拉伯糖和半乳糖醛酸組成，其比例為33.83%和48.17%；硫酸化紅棗多糖由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、果糖和半乳糖醛酸組成，其比例為21.31%、27.38%、7.22%、13.58和30.57%；羧甲基化紅棗多糖由阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，其比例為38.03%、22.37%和39.60%；硒化紅棗多糖主要由阿拉伯糖和半乳糖醛酸組成，其比例為22.28%和53.23%。

2.4 電鏡結(jié)果

多糖掃描電鏡見圖6。

圖6 多糖掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.6 Scanning electron microphotograph of polysaccharide

由圖6可知，紅棗多糖呈不規(guī)則片狀，表面相對平整光滑，結(jié)構(gòu)致密。羧甲基化紅棗多糖在100倍下的表面形態(tài)都呈分散、單片狀分布，表明紅棗多糖的規(guī)則纖維狀結(jié)構(gòu)被破壞，結(jié)構(gòu)疏松，變?yōu)椴灰?guī)則的層狀，在500倍和2 500倍下可看到其表面形狀規(guī)則的圓形小孔[27]。硫酸化紅棗多糖表面不平整，說明硫酸酯化修飾可以改變多糖的表面形態(tài)，使其顆粒變小，表面粗糙，形態(tài)更為復(fù)雜[28]。硒化紅棗多糖有許多條形寬度不一的條形彎曲，放大后表面光滑，觀察到圓形空洞[29]。

2.5 多糖的黏度

采用烏氏黏度計(jì)測量多糖的相對黏度，結(jié)果顯示，在多糖濃度為10 mg/mL且溫度為25℃條件下，紅棗多糖的相對黏度最高，達(dá)到3.29，硒化紅棗多糖的相對黏度為2.83，羧甲基化紅棗多糖的相對黏度為1.57，硫酸化紅棗多糖的相對黏度為1.04。

3 結(jié)論

本研究采用硫酸改性、羧甲基改性以及硒化改性方法對紅棗多糖進(jìn)行改性，硫酸改性和羧甲基改性的多糖含量顯著降低。硫酸化紅棗多糖的取代度為1.65，羧甲基化紅棗多糖的取代度為0.42。硒化紅棗多糖多糖中硒元素含量為（580.15±11.96）μg/g。高效凝膠滲透色譜法分析表明硫酸化紅棗多糖的分子量變化最顯著，其次是羧甲基化紅棗多糖。多糖改性后仍具有多糖特征吸收峰，綜合多糖取代度、紅外光譜、分子量、單糖組成以及掃描電鏡等多方面的結(jié)果分析，表明這3種改性方法對紅棗多糖理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)有較大影響，可以得出多糖改性成功的結(jié)論。本研究為紅棗多糖今后的衍生化修飾提供了一定的理論參考，但是多糖改性的最優(yōu)工藝參數(shù)以及改后的生物活性有待于進(jìn)一步研究。