孫 聰，梅燕萍，崔薇薇，王一杉

（南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，南京市第一醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，南京 210006）

0 引言

血栓分子標志物包含血栓調節(jié)蛋白（TM）、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物（TAT）、組織型纖溶酶原激活物-纖溶酶原激活抑制物-1 復合物（t-PAIC）及纖溶酶-α2 纖溶酶抑制物復合物（PIC），臨床上常簡稱為血栓四項。TM 是由內皮細胞產生的跨膜糖蛋白，生理情況下，TM 通過抑制凝血酶原轉化為凝血酶、捕獲凝血酶使其失去活性并有效激活蛋白C（PC），放大PC 的抗凝效應來發(fā)揮抗凝作用。TM 分為固定型（膜型）和溶解型（血液型），固定型存在于細胞表面，而溶解型游離于血漿和尿液中[1]。TAT 為血液中凝血酶（相對不活躍）與抗凝血酶Ⅲ按1∶1 比例結合形成的復合物，在血液中半衰期較短，為3～15 min。TAT的顯著增加說明機體內凝血系統(tǒng)被激活且處于高水平，提示血栓形成風險，可以較早反映人體凝血功能。t-PAIC 為組織型纖溶酶原激活物（t-PA）與纖溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）以1∶1 比例結合形成的復合物，是用于反映纖溶系統(tǒng)的標志物，其血漿濃度增高提示PAI-1 活性增加，主要反映內皮系統(tǒng)損傷（器官損傷性質）。PIC 是纖溶酶生成后與α2 纖溶酶抑制物以1∶1 比例結合形成的復合物，其半衰期為6 h，可以直接測量并間接反映纖溶酶的生成，彌補了纖溶酶半衰期短、不易檢測的缺陷。在過去的幾十年中，由于檢測手段的局限，這些血栓分子標志物未能廣泛應用于臨床。隨著科學技術的發(fā)展，將化學發(fā)光法應用于分子標志物的檢測后，這些分子標志物在血栓性疾病的診斷、治療及預后判斷中具有更為廣闊的臨床應用前景。

我科于2021 年9月引進了一臺廣州萬孚公司研發(fā)生產的Shine i2900 全自動化學發(fā)光免疫分析儀用于檢測血栓四項。CNAS CL02：2012 文件要求，新的檢測系統(tǒng)在投入使用前必須進行性能驗證。本研究依據中國合格評定國家認可委員會制定的CNAS-GL037：2019《臨床化學定量檢驗程序性能驗證指南》，同時參考WS/T 492—2016[2]、WS/T 408—2012[3]、WS/T 402—2012[4]相關文件對該儀器檢測血栓四項進行性能驗證。

1 資料與方法

1.1 一般資料

5 例高值血漿樣品來源于本院經影像學診斷有血栓形成的臨床患者，健康人群的血漿樣品來源于本院進行健康體檢的人群。參考WS/T 402—2012 標準篩選參加體檢人群，篩選標準為：（1）無各種急慢性疾病；（2）6 個月內未進行手術，4 個月內未獻血、輸血或大量失血，2 周內未服用藥物；（3）無營養(yǎng)不良、素食、酗酒、嗜煙；（4）近期無劇烈運動或重體力勞動；（5）未處于妊娠或哺乳期；（6）實驗室檢查結果正常。

1.2 儀器與試劑

儀器：廣州萬孚公司Shine i2900 全自動化學發(fā)光免疫分析儀。磁微?；瘜W發(fā)光法試劑盒及質控品均為廣州萬孚公司生產，主要包括：TM 測定試劑盒（批號：W39121501F2900），TAT 測定試劑盒（批號：W39221601F2900），t-PAIC 測定試劑盒（批號：W39421601F2900），PIC 測定試劑盒（批號：W39321601F2900）；TM 質控品（批號：W85421601F2900），TAT 質控品（批號：W85521601F2900），t-PAIC 質控品（批號：W85721501F2900），PIC 質控品（批號：W85621501F2900）；TM、TAT、t-PAIC、PIC 校準品（批號：W39121601F2900、W39121501F2900）。

1.3 方法

1.3.1 精密度測試

精密度是保證所有性能驗證試驗正確進行的前提，因此精密度驗證應放在其他性能驗證之前，否則無法保證后續(xù)性能驗證結果的可靠性[5]。選用廣州萬孚公司生產的血栓四項質控品，參考WS/T 492—2016行業(yè)標準進行精密度的評價。每天開機后確認儀器性能符合要求后進行測試。每天測定一批含2 個濃度的質控品，每個濃度連續(xù)測定3 次，由同一名工作人員連續(xù)測定5 d。分別計算出總均值、批內標準差、批間標準差、實驗室內標準差，并據此計算實驗室內變異系數（coefficient of variation，CV）。

1.3.2 正確度測試

在精密度測試滿足要求的前提下，根據GL-037《臨床化學定量檢驗程序性能驗證指南》的要求，通過測定參考物質進行正確度驗證，可通過計算與參考物質的偏倚來判斷是否通過。本次測試通過測量2個濃度的廠商校準品來進行驗證。

先使用批號為W39121601F2900 的校準品進行各檢測項目的定標，再測定批號為W39121501 F2900的校準品進行正確度的驗證。參考CNAS-GL039：2019 的要求，每天測定2 個濃度的校準品4 次，連續(xù)測定5 d。計算出均值，再通過公式：偏倚（%）=，計算出各項目測定均值與校準品參考值之間的偏倚。

1.3.3 線性范圍測試

以WS/T 408—2012 為參考標準，采用多項式回歸分析法進行線性范圍驗證，選擇低濃度（L）和高濃度（H）患者標本各一份，按5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H 混合成6 個樣本。每份混合樣本測定3 次，取平均值作為測定值。將測定值用Grubbs 法進行離群點檢查。如無離群點則采用SPSS 軟件進行回歸統(tǒng)計分析。如計算出的方程為線性方程時，再進行實驗數據的精密度檢查，檢查公式為

1.3.4 臨床可報告范圍測試

選取線性范圍附近的高濃度樣本，用生理鹽水分別按1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40 比例進行稀釋，將配制好的樣本重復檢測2 次取平均值，同時計算出對應稀釋倍數下的理論值。按回收率=（測定值-理論值）/理論值×100%的公式計算回收率，以回收率＜10%作為該稀釋倍數下的測定結果可靠的判斷標準。臨床可報告范圍的上限為線性范圍上限乘以最大稀釋倍數，下限為線性范圍的下限。

1.3.5 參考區(qū)間驗證

參考WS/T 402—2012 標準進行驗證，篩選本院體檢健康人群，按性別分成2 組，每組各20 名，其中男性組22～78 歲，女性組19～84 歲。每組數據先用Dixon 法進行離群點檢查，如有90%的測量值落在參考區(qū)間內，則通過驗證，否則應重新進行參考區(qū)間的確立測試。

1.3.6 穩(wěn)定性測試

選取10 個不同濃度的樣品，設置即刻檢測、常溫放置8 h 及2～4 ℃放置24 h 3 個條件分別對這10個樣本進行測試。通過計算每個樣本常溫放置8 h結果、2～4 ℃放置24 h 結果與即刻檢測結果的相對偏差來驗證其穩(wěn)定性。以相對偏差＜10%、總符合率≥90%為驗證通過。

2 結果

2.1 精密度測試結果

2 個濃度質控品的檢測結果顯示，TM、TAT、PIC、t-PAIC 4 個項目實驗室內CV 均小于2%，滿足廠商宣稱的（CV≤8%）要求，精密度較好。詳見表1。

表1 精密度測試結果

2.2 正確度測試結果

通過測試計算出Shine i2900 全自動化學發(fā)光免疫分析儀檢測TM、TAT、PIC、t-PAIC 4 個項目的偏倚范圍為-7.04%～-2.07%，滿足廠商要求（10%以內），正確度符合要求。詳見表2。

表2 正確度測試結果

2.3 線性范圍測試結果

根據WS/T 408—2012 要求，首先對Shine i2900全自動化學發(fā)光免疫分析儀檢測每個項目得到的18 個數據進行離群點檢查，結果見表3。

以顯著水平σ=0.05，樣本重復測定次數為3次，查Grubbs 臨界值表得臨界值為1.153[3]，而表3 中t1、t2均≤1.153，故判斷數據無離群點，可用于進行多項式回歸分析。

表3 離群點檢查結果

通過表4～7 的數據分析，4 個檢測項目的非線性系數二次回歸多項式的b2、三次回歸多項式的b2和b3與0 之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），故拒絕二次多項式及三次多項式，最適合的多項式均為一次多項式。按前述方法進行精密度檢查結果均通過，證明本次線性范圍測試精密度符合要求，且得出的線性范圍與廠商宣稱值基本一致。詳見表8。

表4 TM 多項式回歸分析結果

表8 精密度檢查及線性范圍結果

2.4 臨床可報告范圍測試結果

對高濃度樣本進行稀釋，計算回收率，結果顯示TAT、TM、PIC、t-PAIC 4 個檢測項目的最大稀釋倍數均為40 倍。詳見表9。

表9 最大稀釋倍數結果

結合最大稀釋倍數與線性范圍結果可計算出血栓四項的可報告范圍，即TM 為1.02～8001.20TU/mL，TAT為0.50～4800.00 ng/mL，PIC 為0.06～1617.20 μg/mL，t-PAIC 為0.50～4000.00 ng/mL。

表5 TAT 多項式回歸分析結果

表6 PIC 多項式回歸分析結果

2.5 參考區(qū)間驗證結果

本次驗證采用Dixon 法進行離群點檢查，未發(fā)現存在離群點。TAT（女性）、PIC（女性）驗證的符合率為90%，TAT（男性）、t-PAIC（女性）驗證的符合率為95%，其余檢測項目的符合率為100%，所有檢測項目參考區(qū)間驗證均符合要求。詳見表10。

表10 參考區(qū)間驗證結果

表7 t-PAIC 多項式回歸分析結果

2.6 穩(wěn)定性測試結果

10 份樣本在常溫8 h 和2～4 ℃24 h 下放置后，檢測結果與即刻檢測的結果進行比較，相對偏差均在10%以內，符合率為100%。詳見表11～14。

表11 TM 穩(wěn)定性測試結果

3 討論

近年來，血栓性疾病的發(fā)病率越來越高，而血栓性疾病中，靜脈血栓占有較高的比例。大部分的靜脈血栓發(fā)病前都沒有明顯的癥狀，但靜脈血栓常會引起肺栓塞，導致嚴重的后果。據《中國血栓性疾病防治指南》要求，預防靜脈血栓的工作尤為重要[6]。當血漿TAT、PIC、TM、t-PAIC 水平升高時，可反映早期深靜脈血栓形成發(fā)生時內皮細胞損傷和凝血纖溶系統(tǒng)失衡情況，這4項指標可作為影響孕中晚期靜脈血栓發(fā)生的獨立預測因子，聯合檢測可為臨床早期診斷提供參考。血栓四項也可用于彌散性血管內凝血的早期檢測。目前對彌散性血管內凝血的檢測主要是以篩查為主，無法早期發(fā)現、分型。彌散性血管內凝血治療效果判定的臨床指標與原發(fā)性疾病癥狀是否改善很難區(qū)分，目前實驗室檢查指標主要是血小板計數、纖維蛋白原及纖維蛋白降解產物，這3 個指標的恢復比較慢，無法實時反映疾病狀態(tài)。據多項研究表明，TM、PIC 和t-PAIC的水平升高可以早期預測膿毒癥患者彌散性血管內凝血的發(fā)生，聯合預測的價值優(yōu)于單個檢測，其中當TM＞11.5 TU/mL 時膿毒癥患者死亡風險升高，聯合序貫性器官衰竭評分（sequential organ failure assessment，SOFA）≥1 分可為診斷膿毒癥相關性凝血病提供參考[7-8]。

Shine i2900 全自動化學發(fā)光免疫分析儀是基于磁微?；瘜W發(fā)光法進行血栓四項的檢測，具有檢測速度快、操作簡便的特點，適合常規(guī)實驗室開展。根據ISO 15189：2012 要求，實驗室在引入新的檢測系統(tǒng)前，需進行獨立驗證，應通過獲取客觀數據證實檢驗程序的性能與其聲明相符。

本次實驗參考WS/T 492—2016，選用2 個濃度的質控品進行精密度測試，得出血栓四項的實驗室內CV 均小于2%。因該項目為新開展項目，衛(wèi)生部臨床檢驗中心尚未提供評價標準，故參考廠商說明書的聲明值（CV≤8%），該儀器的精密度良好。之后通過測量2 個濃度的廠商校準品來進行正確度驗證，4 個檢測項目的偏倚為-7.04%～-2.07%，結果存在一定的負偏倚，偏倚度滿足廠商要求，正確度也符合要求。

表12 TAT 穩(wěn)定性測試結果

表13 PIC 穩(wěn)定性測試結果

線性是指在給定的范圍內，測定結果與檢測分析物的量直接成比例的能力，實驗室正確評價檢測系統(tǒng)的線性范圍才能保證檢測結果的有效性。本次線性范圍測試在驗證實驗數據無離群點存在的前提下，回歸分析顯示4 個檢測項目均為一次多項式為最適多項式，實驗數據的精密度檢查也符合要求。本次驗證的線性范圍TM 為1.02～200.03 TU/mL，TAT 為0.50～120.00 ng/mL，PIC 為0.06～40.43 μg/mL，t-PAIC為0.50～100.00 ng/mL，與廠商宣稱范圍基本一致，可滿足臨床要求。

表14 t-PAIC 穩(wěn)定性測試結果

可報告范圍是檢測方法所能定量報告的分析物值的范圍，允許對樣本進行稀釋、濃縮或者其他預處理，擴展了患者結果的可報告范圍，其上限的確定一般采用線性稀釋回收法[9-12]。本次實驗結果表明血栓四項最大稀釋倍數均為40 倍，在最大稀釋倍數時的可回收率均＜10%。以線性范圍下限作為可報告范圍的下限，線性范圍上限和最大可稀釋倍數的乘積作為可報告范圍的上限，可得出Shine i2900 全自動化學發(fā)光免疫分析儀檢測血栓四項的臨床可報告范圍。

本次實驗從健康體檢人群中按性別篩選出2組，每組20 人，進行了參考區(qū)間的驗證。在排除離群點干擾的可能性后，有大于90%的結果落在廠商提供的參考區(qū)間內，證明廠商給出的參考區(qū)間在本實驗室適用。

合格的血漿樣本是保證檢測結果準確可靠的前提，其受血液樣本采集和處理的一系列環(huán)節(jié)（如采血器具的選擇、抗凝劑的使用、采血技術、血漿樣本的獲取和樣本的轉運及保存等）影響。實驗室進行常規(guī)凝血項目，如凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）等檢測時均要求在常溫條件下分離血漿，4 h 內完成檢測[13]。血栓四項作為新型的血栓檢測項目，對樣本穩(wěn)定性的要求未見相關報道。本次實驗比對了常溫放置8 h、2～4 ℃放置24 h 后與即刻檢測的樣本，比對結果的偏差均在10%以內。結果表明在上述存儲條件下，用于血栓四項檢測的樣本性狀穩(wěn)定。

綜上，本次性能評價從精密度、正確度、線性范圍、臨床可報告范圍、參考區(qū)間驗證、穩(wěn)定性測試6個方面對Shine i2900 全自動化學發(fā)光免疫分析儀檢測血栓四項進行了驗證，綜合結果顯示該儀器檢測血栓四項的效能均達到廠商宣稱指標，可滿足臨床使用要求。