劉玉芳，陳玉林，周祖陽，儲明星

miR-221-3p靶向調控小尾寒羊卵泡顆粒細胞凋亡

1中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所/農業(yè)農村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056001

【】在哺乳動物中能夠促進多種細胞凋亡，同時參與繁殖性狀相關組織器官的發(fā)育及疾病治療，文章利用分子生物學方法探究miR-221-3p靶向調控對小尾寒羊卵泡顆粒細胞凋亡的影響，為進一步研究在卵泡顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖過程中的調控作用提供依據(jù)。在前期課題組卵巢組織全轉錄組測序分析的基礎上，獲得了候選基因及其調控元件miR-221-3p，利用半定量和組織熒光定量（RT-qPCR）分析在小尾寒羊不同組織中的表達情況；通過RT-qPCR定量試驗在小尾寒羊卵泡期和黃體期卵巢組織中鑒定了及miRNA-221-3p的表達情況；構建3’UTR野生型和突變型載體，在HEK293T細胞中共轉染miR-221-3p mimic和野生型和突變型及陰性對照，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)確定miR-221-3p與靶向性關系；在綿羊卵巢原代顆粒細胞中轉染miR-221-3p mimic及陰性對照實現(xiàn)miR-221-3p過表達，使用RT-qPCR技術在mRNA水平上檢測miR-221-3p對以及卵巢顆粒細胞凋亡標志基因和表達水平的影響；同時利用EdU試驗分析miR-221-3p過表達和陰性對照組中顆粒細胞的增殖變化。半定量和組織RT-qPCR分析均表明在卵巢組織中表達量高于其他組織；RT-qPCR定量結果顯示miR-221-3p和在小尾寒羊卵泡期和黃體期卵巢組織中差異表達，miR-221-3p在卵泡期卵巢中的表達量高于黃體期，而在卵泡期卵巢中的表達量低于黃體期，表現(xiàn)出負調控的現(xiàn)象；雙熒光素酶報告基因驗證分析顯示，過表達miR-221-3p mimic顯著抑制了3’UTR熒光素酶的活性（＜0.05），陰性對照組則沒有顯著影響；過表達miR-221-3p，靶基因mRNA表達水平顯著降低，同時，卵泡顆粒細胞凋亡標志基因和的表達量也顯著降低（＜0.05）；EdU試驗分析顯示，過表達miR-221-3p的顆粒細胞增殖率為18.9%，極顯著高于陰性對照組的10.43%（＜0.01）。和miR-221-3p是調控綿羊卵巢發(fā)育的重要基因及調控元件，是miR-221-3p的靶基因之一，miR-221-3p過表達可抑制顆粒細胞凋亡，該作用結果可能通過抑制靶基因的表達進而影響了綿羊卵巢顆粒細胞的凋亡。

miR-221-3p；小尾寒羊；卵巢顆粒細胞凋亡；

0 引言

【研究意義】產(chǎn)羔數(shù)一直是制約綿羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的核心問題，影響產(chǎn)羔數(shù)的決定因素是排卵率和卵泡發(fā)育。卵泡顆粒細胞為卵泡發(fā)育提供營養(yǎng)物質，顆粒細胞的增殖或凋亡是影響卵泡發(fā)育和排卵數(shù)增減的重要因素[1]。多種影響因素調控顆粒細胞凋亡，包括遺傳、營養(yǎng)、激素等[2]。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，揭示其增殖或凋亡的分子機制成為新的研究熱點。microRNA作為近年來研究成熟的表觀遺傳學調控元件，在細胞發(fā)育過程中起到重要的轉錄后調控作用[3]。顆粒細胞直接影響卵泡發(fā)育，了解其增殖的內在分子調控機制可為提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)和排卵率提供研究基礎[4]。本研究將miRNA-mRNA調控作用作為探究卵巢顆粒細胞發(fā)育的重要調控通路，通過RT-qPCR試驗在組織中檢測了miRNA及mRNA的表達情況，確定了其作為影響小尾寒羊卵巢發(fā)育的重要候選基因及調控元件參與卵巢顆粒細胞發(fā)育，為進一步驗證miRNA-mRNA的靶向性關系及在細胞水平上該調控通路的功能提供了理論基礎。【前人研究進展】自從1985年，Piper等在Booroola美利奴羊中發(fā)現(xiàn)多羔主效基因以來，在遺傳上對綿羊多羔性狀的研究從沒有停止過[5]。此外，和基因也被發(fā)現(xiàn)與綿羊多羔性狀相關[6-7]。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，越來越多的技術應用于綿羊多羔性狀的研究，例如，利用GWAS、轉錄組學、蛋白質組學等多種高通量測序技術篩選與綿羊多羔性狀相關的重要候選基因，并對篩選后的基因進行功能驗證[8-10]。編碼BCL2L11蛋白，屬于BCL-2蛋白家族的一員，位于線粒體的外膜，該蛋白在介導興奮性細胞凋亡、誘導基因序列易位和線粒體去極化的過程中起著重要的調控作用[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，BCL2L11與BCL2、BCL2L1和BCL2L3相互作用，是細胞凋亡的激活劑[13]，當細胞被有毒物質刺激時，BCL2L11從DYNLL1中釋放出來，通過BCL2失活和BCL-2相關蛋白（BAX）-BCL2拮抗劑的激活誘導細胞凋亡[14]。參與治療子宮內膜異位癥，研究表明，LINC00261通過直接與miR-132-3p結合來充當調節(jié)表達的分子海綿，該通路可能是子宮內膜異位癥的新型治療靶標[15]。在妊娠前期癲癇患者的胎盤中發(fā)現(xiàn)miR-222通過上調靶基因來促進子癇前期患者對缺氧的應答，進而促進間充質干細胞的凋亡[16]。研究發(fā)現(xiàn)能夠促進多種細胞凋亡，且該基因參與繁殖性狀相關組織器官的發(fā)育及疾病治療，但目前在綿羊卵泡顆粒細胞中的作用仍不清楚。miRNAs 是有機體內基因轉錄后表達調控的主要表觀遺傳學修飾方法之一，在綿羊多羔性狀的研究中發(fā)現(xiàn)多個miRNAs參與調控該性狀。let-7和oar-miRNA-200家族成員，不僅在綿羊中具有物種特異性，而且還具有階段特異性或繁殖力特異性[17]。miR-221-3p 在子宮頸鱗狀細胞癌臨床標本的miRNA芯片中高表達，且miR-221-3p可通過抑制轉移到人淋巴管內皮細胞中可促進淋巴管生產(chǎn)和淋巴轉移，并可作為子宮頸鱗狀細胞癌患者早期治療的新型診斷生物標記物和治療靶標[18]，miR-221-3p與子宮頸癌的復發(fā)和轉移有關，其受轉錄因子TWIST2的上調，從而抑制了的表達，該通路可能促進子宮頸癌淋巴結轉移，從而影響雌性動物的繁殖[19]。綜上可知，miR-221-3p可能通過抑制其靶基因的表達調控雌性繁殖相關性能?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期通過對小尾寒羊卵泡期和黃體期的卵巢組織進行全轉錄組測序，篩選到與綿羊多羔性狀相關候選基因及其調控元件miR-221-3p。基于前期試驗結果與已有報道，可以調控細胞凋亡，并且與雌性動物繁殖有關，miR-221-3p也可作為重要的調控元件調控與生殖有關的疾病變化，推測miR-221-3p可通過抑制的表達影響卵泡顆粒細胞的增殖或凋亡，這有助于進一步闡述卵泡顆粒細胞發(fā)育的分子生物學機制?！緮M解決的關鍵問題】以小尾寒羊卵巢組織和卵泡顆粒細胞為試驗材料，在組織和細胞的轉錄水平鑒定miR-221-3p和靶基因的表達情況，驗證過表達miR-221-3p調控靶基因表達，并通過鑒定卵泡顆粒細胞凋亡標志因子和的表達、EdU分析等進一步驗證試驗結果。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

試驗所用小尾寒羊均飼養(yǎng)于天津市畜牧獸醫(yī)研究所試驗羊場，選取3周歲經(jīng)產(chǎn)、健康狀況良好的母羊6只（卵泡期和黃體期各3只），所有試驗羊飼養(yǎng)環(huán)境均相同。屠宰后，取其心臟、肝臟、脾臟、肺、胃、下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管等組織，取樣后迅速裝入2 mL RNase-Free凍存管中，所有組織樣品采集均在屠宰后半小時內完成，采完后迅速放入液氮，最后于-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。綿羊卵巢顆粒細胞由農業(yè)農村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室前期分離保存獲得，HEK293T細胞從北京綠源博德公司購買所得，細胞儲存于液氮中，備用。

1.2 主要試劑

組織/細胞RNA提取試劑盒（天根，北京）、cDNA反轉錄試劑盒（天根，北京）、SYBR Green qPCR Mix試劑盒（天根，北京）；miRNA定量引物、mimic及inhibitor由廣州銳博生物科技有限公司（中國）合成；DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶購自Gbico（美國）；Lipofectamine?2000轉染試劑盒購自Invitrogen（美國）；雙熒光素酶活性測定試劑盒購自Promega（美國），其他均為常規(guī)化學試劑。

1.3 小尾寒羊卵巢組織RNA提取及cDNA合成

將采集的卵泡期和黃體期小尾寒羊各組織在液氮中進行研磨，然后用Trizol（Invitrogen，美國）進行裂解，并根據(jù)動物組織總RNA提取試劑盒（天根，北京）的說明進行總RNA的提取，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測提取RNA的質量和濃度。經(jīng)檢驗合格的組織總RNA置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。用TaKaRa反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，反轉錄體系總體積為20 μL：PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Random 6 mers 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer（for Real Time）4.0 μL，RNA 1.0 μg，RNase-Free ddH2O補足至20 μL，全程在冰上操作。反轉錄反應條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。反轉錄得到cDNA后，用持家基因進行PCR檢測，經(jīng)檢測合格的cDNA置于-20℃保存，備用。

1.4 miR-221-3p和BCL2L11小尾寒羊卵巢組織表達量檢測

根據(jù)GenBank提供的綿羊和基因序列（登錄號分別為XM_012173883.3和XM_ 004012836.3），利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，其中作為內參基因。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成，miR-221-3p及U6引物由廣州銳博生物科技有限公司（中國）合成。各引物濃度均為10 μmol·L-1，其他詳細信息見表1。

表1 引物的序列、擴增片段大小及退火溫度

1.5 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗證

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的綿羊的3′UTR序列，設計相關引物以擴增與miR-221-3p種子序列完全匹配的基因片段。使用載體為pmiR-RB- Report，在PCR上下游引物的5′端分別添加I和I兩個酶切位點，同時合成了野生型及突變位點，序列見圖1，紅色字體為miR-221-3p種子序列核心結合區(qū)（載體由廣州銳博生物公司構建）。PCR擴增體系：模板1 μL，2×Taq PCR Mastermix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，加ddH2O補足至20 μL。PCR反應程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，34個循環(huán)；72℃ 10 min。

將HEK293T細胞復蘇后，傳至2代以上，以1×104個/孔的密度接種到24孔板中，每孔放500 μL DMEM完全培養(yǎng)基。待細胞生長到80%—90%匯合，更換無血清的Opti-MEM優(yōu)化培養(yǎng)基。分別將2 μL Lipo 2000 和pmiR-RB--WT（野生型）/ pmiR- RB--MT（突變型）載體和1 μL 50 nmol·L-1的oar-miR-221-3p mimic或mimic NC進行混合，混勻后轉染到鋪好的293T細胞中，轉染4 h后換成含有10%血清的完全培養(yǎng)基，48 h后收細胞進行雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

圖1 miR-221-3p與靶基因BCL2L11結合位點預測及載體構建

1.6 卵泡顆粒細胞轉染

將卵巢顆粒細胞以1×106個/孔的密度接種到6孔板中（每組3個重復），每孔中放2 mL DMEM完全培養(yǎng)基。待細胞生長到80%—90%密度時，更換培養(yǎng)基為Opti-MEM優(yōu)化培養(yǎng)基（不含血清）。將10 μL 的Lipo 2000和4 μL 100 ng·μL-1的oar-miR-221-3p mimic/inhibitor及NC（由廣州銳博生物科技有限公司（中國）合成）分別添加到250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中，混合后，室溫下孵育20min，進行細胞轉染。4 h后更換為完全培養(yǎng)基，48 h后收集細胞。

1.7 卵泡顆粒細胞RNA提取及RT-qPCR檢測

使用細胞總RNA提取試劑盒提取卵泡顆粒細胞總RNA，用PrimeScript RT試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。RT-qPCR實驗步驟同1.4中組織定量步驟。用于RT-qPCR的引物序列見表1。

1.8 EdU檢測

按照1.6中顆粒細胞轉染步驟進行轉染，根據(jù)試劑盒說明書（碧云天，北京）配置EdU工作液，向每孔加500 μL 10 μmol·L-1EdU工作液，將細胞再培養(yǎng)3 h。然后用PBS清洗細胞，用4%的多聚甲醛固定30 min。為了中和多余的醛基，每孔加入50 μL 2 mg·mL-1的甘氨酸孵育15 min。每孔中加入100 μL 0.5% Triton X-100孵化15 min。沖洗后，加入100 μL Apollo試劑，室溫下避光孵化30 min。用PBS清洗細胞，然后用Hoechst 33342反應液在暗房中對細胞核進行染色30 min。使用熒光顯微鏡對EdU染色的細胞進行觀察和量化。隨機選擇3個區(qū)域進行量化和用ImageJ軟件進行統(tǒng)計分析。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有結果以“平均值±標準差”表示。熒光定量PCR測定數(shù)據(jù)采用獨立樣本檢驗分析，雙熒光素酶報告基因試驗所得的數(shù)據(jù)通過單因素ANOVA方差分析進行評估，*＜0.05，**＜0.01代表組間差異具有統(tǒng)計學意義。所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 20.0軟件進行。

2 結果

2.1 BCL2L11組織表達譜分析

利用半定量和實時定量PCR檢測在小尾寒羊各個組織中的表達情況，結果表明，在小尾寒羊心臟、肝臟、脾臟、肺、胃、下丘腦、垂體、卵巢、子宮和輸卵管10個組織中均有表達，RT-qPCR和半定量表達譜均顯示在卵巢組織中表達量最高（圖2）。

A: BCL2L11半定量分析；B: BCL2L11相對表達量分析。M: Marker; 1—10分別為心臟、肝臟、脾臟、肺、胃、下丘腦、垂體、卵巢、子宮、輸卵管

2.2 miR-221-3p和BCL2L11在小尾寒羊卵巢組織中表達量情況

通過對卵泡期和黃體期小尾寒羊卵巢組織中miR-221-3p和RT-qPCR定量試驗檢測，發(fā)現(xiàn)在黃體期卵巢組織中的表達量顯著高于卵泡期，而miR-221-3p的表達量則相反（＜0.05）（圖3）。推測是miR-221-3p的靶基因之一，并且該基因與綿羊卵泡期到黃體期的轉變有關。

2.3 miR-221-3p與BCL2L11靶向性驗證

為了進一步研究miR-221-3p與靶向性關系，通過Targetscan在線軟件預測了miR-221-3p在基因上結合位置，發(fā)現(xiàn)基因的3′UTR區(qū)存在miR-221-3p的特異性結合位點，隨后以NCBI中提供的3′UTR為模板設計了包含miR-221-3p種子序列結合位點片段的引物，進行PCR擴增。構建了野生型重組質?！皃miR-RB--WT”和突變型重組質粒“pmiR-RB--MT”。試驗分為4組，分別是pmiR-RB--WT、miR-221-3p mimic；pmiR-RB--WT、mimic NC；pmiR-RB--MT、miR-221-3p mimic；pmiR-RB-- MT、mimic NC，每組設3個重復孔，共轉染HEK293T細胞。結果顯示，過表達miR-221-3p顯著降低了野生型質粒的熒光活性（＜0.05）；但對突變型質粒沒有顯著作用（＞0.05）；陰性對照對各組質粒的熒光活性都沒有顯著影響（＞0.05）（圖4）。結果表明miR-221-3p可與3′UTR區(qū)的種子序列結合，是其靶基因之一。

LP：黃體期；FP：卵泡期LP: luteal phase; FP: follicular phase *P＜0.05 下同The same as below

2.4 過表達miR-221-3p對BCL2L11表達的影響

為了確定miR-221-3p是否能夠調控的表達，本試驗利用miR-221-3p mimic和mimic NC轉染綿羊卵泡顆粒細胞。轉染48 h后收集細胞提取總RNA進行靶基因RT-qPCR定量檢測。結果顯示，與空白對照相比，過表達miR-221-3p組中mRNA表達量顯著降低（＜0.05）；陰性對照組（mimic NC）中對表達量無顯著影響（圖5），表明miR-221-3p與之間存在靶向性關系，并且在轉錄水平是負調控的。

2.5 過表達miR-221-3p對卵泡顆粒細胞凋亡標志因子XIAP和Fas表達的影響

為了確定綿羊miR-221-3p是否通過調控表達影響卵泡顆粒細胞凋亡，本試驗利用miR-221-3p mimic和mimic NC轉染到綿羊卵泡顆粒細胞中，轉染48 h后收集細胞提取總RNA，通過RT-qPCR檢測卵泡顆粒細胞凋亡標志基因和在mRNA水平上的相對表達量。結果顯示，轉染miR-221-3p mimic后，和的mRNA表達量顯著降低（＜0.05）（圖6-A）。EdU分析顯示，過表達miR-221-3p的顆粒細胞增殖率為18.9%，極顯著高于陰性對照組的10.43%（**＜0.01，圖6-B）。

圖4 miR-221-3p與BCL2L11靶向關系的雙熒光素酶活性檢測

圖5 過表達miR-221-3p抑制了BCL2L11的表達

3 討論

綿羊繁殖性狀十分復雜，受到卵泡發(fā)育、排卵率、發(fā)情周期轉變等的影響。卵泡顆粒細胞為卵泡提供營養(yǎng)物質，其增殖和凋亡直接影響卵母細胞的閉鎖、發(fā)育和成熟。在雌性哺乳動物中，單層的卵泡顆粒細胞包裹著卵母細胞，隨著卵泡的不斷發(fā)育，顆粒細胞形態(tài)也隨之發(fā)生變化，由扁平生長為柱狀，由單層生長為多層，在此過程中顆粒細胞不斷為卵母細胞提供能量，包括氨基酸、核苷酸、谷胱甘肽和糖代謝物等[20]。在單胎哺乳動物中，每個發(fā)情周期卵巢組織中只有1個卵泡可以發(fā)展為優(yōu)勢卵泡發(fā)育成熟并排卵，其余卵泡均閉鎖凋亡，有研究發(fā)現(xiàn)卵泡閉鎖是由于卵泡顆粒細胞的凋亡造成的[21-22]。在小尾寒羊群體中存在單羔和多羔個體現(xiàn)象，在排卵過程中很好地體現(xiàn)了多個優(yōu)勢卵泡同時發(fā)育成熟并排卵形成多羔，該群體可為研究多羔性狀產(chǎn)生的分子機制提供研究基礎和試驗材料。前人研究結果顯示，可通過的反式激活參與人顆粒細胞凋亡，是參與顆粒細胞凋亡的重要調控基因[23]。在本研究中發(fā)現(xiàn)在綿羊各組織中廣泛存在（圖2），但是在卵巢組織中高表達，因此，該結論與前人的研究結果一致，參與卵巢組織發(fā)育。

A：過表達miR-221-3p抑制XIAP和Fas表達；B: EdU檢測顆粒細胞凋亡

miRNA作為目前研究比較成熟的轉錄后調控元件，參與有機體生長、發(fā)育、繁殖及衰亡的各個環(huán)節(jié)。在細胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)多個miRNAs參與細胞凋亡過程。研究表明，miR-1275、let-7家族、miR-23a等，均參與了卵泡顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖過程，其中l(wèi)et-7家族在豬卵泡閉鎖過程中高水平表達，可以顯著提高豬卵泡顆粒細胞的凋亡率[24-26]。作為影響卵泡顆粒細胞發(fā)育的重要候選基因，miRNA如何調控該基因表達的報道較少。本研究通過前期全轉錄組測序數(shù)據(jù)進行生物學分析發(fā)現(xiàn)miR-221-3p是調控表達的miRNA之一，通過雙熒光素酶報告基因活性檢測發(fā)現(xiàn)存在miR-221-3p的靶向性結合位點，在模式化細胞293T細胞系中其mimic能夠結合到的3′UTR區(qū)域。此外，研究發(fā)現(xiàn)，miR-221-3p主要參與治療癌癥及炎癥反應，抑制miR-221-3p的表達則可能促進膠質瘤細胞的凋亡，表明低表達的miR-221-3p更有可能造成細胞凋亡[27]。該文獻佐證了miR-221-3p低表達對靶基因的抑制作用不足，會影響卵泡顆粒細胞的凋亡，與目前所發(fā)現(xiàn)的功能一致。

和是細胞凋亡的關鍵細胞因子，可作為檢測卵泡顆粒細胞凋亡重要標志[28-29]。在本研究中，過表達miR-221-3p后表達量顯著降低，而標志因子和的mRNA表達量也顯著降低，這與前人在豬卵泡顆粒細胞中所得到的結果相似[30]，說明miR-221-3p能夠通過抑制的表達顯著影響顆粒細胞的凋亡。

4 結論

研究發(fā)現(xiàn)miR-221-3p靶向調控表達對綿羊卵泡顆粒細胞凋亡有顯著影響。過表達miR-221-3p可以抑制的表達從而調控綿羊顆粒細胞凋亡，表明具有調控綿羊顆粒細胞凋亡的作用，為進一步研究在綿羊卵泡顆粒細胞中的調控機制奠定了理論基礎。

[1] 付靖波, 張紅霞, 朱海英. 顆粒細胞凋亡調控機制及其在卵泡發(fā)育中的作用. 中國臨床醫(yī)學, 2020(5):857-860. doi:10.12025/j.issn. 1008-6358.2020.20191161.

FU J B, ZHANG H X, ZHU H Y. Regulation mechanisms of granulosa cells apoptosis and its role in follicular development. Chinese Journal of Clinical Medicine, 2020(5):857-860.(in Chinese) doi:10.12025/j.issn.1008-6358.2020.20191161.

[2] ASSELIN E, XIAO C W, WANG Y F, TSANG B K. Mammalian follicular development and atresia: role of apoptosis. Biological Signals & Receptors, 2000, 9(2): 87-95.

[3] 徐子雯, 楊珖, 姚桂東. 微小RNA在卵巢卵泡發(fā)育中的調控作用. 中華生殖與避孕雜志, 2020(10):847-852. doi:10.3760/cma.j. cn101441-20191008-00440.

XU Z W, YANG G, YAO G D. Regulation of microRNA in ovarian follicular development. Chinese Journal of Reproduction and Contraception, 2020(10):847-852. doi:10.3760/cma.j.cn101441-20191008- 00440. (in Chinese)

[4] 范冰峰, 趙向遠, 韓玉萍, 李文, 李曉霞, 許保增. 顆粒細胞對卵母細胞成熟和排卵影響研究進展. 特產(chǎn)研究, 2020(5): 78-83.

FAN B F, ZHAO X Y, HAN Y P, LI W, LI X X, XU B Z. Research progress on effects of granulosa cells on oocyte maturation and ovulation. Special Wild Economic Animal and Plant Research, 2020(5): 78-83. (in Chinese)

[5] PIPER L R, BINDON B M, DAVIS G H. The single gene inheritance of the high litter size of the Booroola Merino//LAND R B, ROBINSON D W. eds. Genetics of Reproduction in Sheep. London, UK: Butterworths, 1985:115-125.

[6] SILVA J R, VAN DEN HURK R, VAN TOL H T, ROELEN B A, FIGUEIREDO J R. Expression of growth differentiation factor 9 (GDF9), bone morphogenetic protein 15 (BMP15), and BMP receptors in the ovaries of goats. Molecular Reproduction and Development, 2005, 70(1): 11-19. doi:10.1002/mrd.20127.

[7] PRAMOD R K, SHARMA S K, SINGHI A, PAN S, MITRA A. Differential ovarian morphometry and follicular expression of BMP15, GDF9 and BMPR1B influence the prolificacy in goat. Reproduction in Domestic Animals, 2013, 48: 803-809.

[8] WANG W, ZHANG X, ZHOU X, ZHANG Y, LA Y, ZHANG Y, LI C, ZHAO Y, LI F, LIU B, JIANG Z. Deep genome resequencing reveals artificial and natural selection for visual deterioration, plateau adaptability and high prolificacy in Chinese domestic sheep. Frontiers in Genetics, 2019, 10: 300. doi:10.3389/fgene.2019.00300.

[9] POKHAREL K, PEIPPO J, HONKATUKIA M, SEPP?L? A, RAUTIAINEN J, GHANEM N, HAMAMA T M, CROWE M A, ANDERSSON M, LI M H, KANTANEN J. Integrated ovarian mRNA and miRNA transcriptome profiling characterizes the genetic basis of prolificacy traits in sheep (). BMC Genomics, 2018, 19(1): 104. doi:10.1186/s12864-017-4400-4.

[10] MIAO X, LUO Q, ZHAO H, QIN X. Ovarian proteomic study reveals the possible molecular mechanism for hyperprolificacy of Small Tail Han sheep. Scientific Reports, 2016, 6: 27606. doi:10.1038/srep27606.

[11] CONCANNON C G, TUFFY L P, WEISOVá P, BONNER H P, DáVILA D, BONNER C, DEVOCELLE M C, STRASSER A, WARD M W, PREHN J H. AMP kinase-mediated activation of the BH3-only protein Bim couples energy depletion to stress-induced apoptosis. Journal of Cell Biology, 2010, 189(1):83-94.

[12] KILBRIDE S M, FARRELLY A M, BONNER C, WARD M W, NYHAN K C, CONCANNON C G, WOLLHEIM C B, BYRNE M M, PREHN J H. AMP-activated protein kinase mediates apoptosis in response to bioenergetic stress through activation of the pro-apoptotic Bcl-2 homology domain-3-only protein BMF. The Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(46): 36199-36206. doi:10.1074/jbc. m110.138107.

[13] O’CONNOR L, STRASSER A, O’REILLY L A, HAUSMANN G, ADAMS J M, CORY S, HUANG D C. Bim: a novel member of the Bcl-2 family that promotes apoptosis. EMBO Journal, 1998, 17(2): 384-395.

[14] PERIER C, BOVé J, WU D C, DEHAY B, CHOI D K, JACKSON- LEWIS V, RATHKE-HARTLIEB S, BOUILLET P, STRASSER A, SCHULZ J B, PRZEDBORSKI S, VILA M. Two molecular pathways initiate mitochondria-dependent dopaminergic neurodegeneration in experimental Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, 104(19): 8161-8166.

[15] WANG H, SHA L, HUANG L, YANG S, ZHOU Q, LUO X, SHI B. LINC00261 functions as a competing endogenous RNA to regulate BCL2L11 expression by sponging miR-132-3p in endometriosis. American Journal of Translational Research, 2019, 11(4): 2269-2279.

[16] QU H M, QU L P, PAN X Z, MU L S. Upregulated miR-222 targets BCL2L11 and promotes apoptosis of mesenchymal stem cells in preeclampsia patients in response to severe hypoxia. International Journal of Clinical and Experimental Pathology, 2018, 11(1): 110-119.

[17] ZHAI M, XIE Y, LIANG H, LEI X, ZHAO Z. Comparative profiling of differentially expressed microRNAs in estrous ovaries of Kazakh sheep in different seasons. Gene, 2018, 664: 181-191. doi:10.1016/j. gene.2018.04.025.

[18] ZHOU C F, MA J, HUANG L, YI H Y, ZHANG Y M, WU X G, YAN R M, LIANG L, ZHONG M, YU Y H, WU S, WANG W. Cervical squamous cell carcinoma-secreted exosomal miR-221-3p promotes lymphangiogenesis and lymphatic metastasis by targeting VASH1. Oncogene, 2019, 38(8): 1256-1268. doi:10.1038/s41388-018-0511-x

[19] WEI W F, ZHOU C F, WU X G, HE L N, WU L F, CHEN X J, YAN R M, ZHONG M, YU Y H, LIANG L, WANG W. microRNA-221-3p, a TWIST2 target, promotes cervical cancer metastasis by directly targeting THBS2. Cell Death & Disease, 2017, 8(12): 3220. doi:10. 1038/s41419-017-0077-5.

[20] LUBUSKY M, PROCHAZKA M, DHAIFALAH I, HORAK D, GEIEROVA M, SANTAVY J. Fetal enterolithiasis: Prenatal sonographic and MRI diagnosis in two cases of urorectal septum malformation (URSM) sequence. Prenatal Diagnosis, 2006, 26(4): 345-349. doi:10.1002/pd.1415.

[21] HUGHES F M, GOROSPE W C. Biochemical identification of apoptosis (programmed cell death) in granulosa cells: Evidence for a potential mechanism underlying follicular atresia. Endocrinology, 1991, 129(5): 2415-2422.

[22] FU X, HE Y, WANG X, PENG D, CHEN X, LI X, WAN Q. microRNA-16 promotes ovarian granulosa cell proliferation and suppresses apoptosis through targeting PDCD4 in polycystic ovarian syndrome. Cellular Physiology and Biochemistry, 2018, 48(2): 670-682. doi:10.1159/000491894.

[23] MATSUDA F, INOUE N, MAEDA A, CHENG Y, SAI T, GONDA H, GOTO Y, SAKAMAKI K, MANABE N. Expression and function of apoptosis initiator FOXO3 in granulosa cells during follicular atresia in pig ovaries. The Journal of Reproduction and Development, 2011, 57(1): 151-158. doi:10.1262/jrd.10-124h.

[24] LIU J, LI X, YAO Y, LI Q, PAN Z, LI Q. miR-1275 controls granulosa cell apoptosis and estradiol synthesis by impairing LRH-1/CYP19A1 axis. Biochimica et Biophysica Acta Gene Regulatory Mechanisms, 2018, 1861(3): 246-257. doi:10.1016/j.bbagrm.2018.01.009.

[25] ZHUANG R J, BAI X X, LIU W. MicroRNA-23a depletion promotes apoptosis of ovarian cancer stem cell and inhibits cell migration by targeting DLG2. Cancer Biology & Therapy, 2019, 20(6): 897-911.

[26] CAO R, WU W J, ZHOU X L, XIAO P, WANG Y, LIU H L. Expression and preliminary functional profiling of the let-7 family during porcine ovary follicle atresia. Molecules and Cells, 2015, 38(4): 304-311. doi:10.14348/molcells.2015.2122.

[27] MILANI R, BROGNARA E, FABBRI E, MANICARDI A, CORRADINI R, FINOTTI A, GASPARELLO J, BORGATTI M, COSENZA L C, LAMPRONTI I, DECHECCHI M C, CABRINI G, GAMBARI R. Targeting miR1555p and miR2213p by peptide nucleic acids induces caspase3 activation and apoptosis in temozolomide resistant T98G glioma cells. International Journal of Oncology, 2019, 55(1): 59-68. doi:10.3892/ijo.2019.4810.

[28] 蔣鵬飛, 覃艮艷, 彭曉芳, 張又瑋, 彭俊, 彭清華. 密蒙花顆粒劑對去勢雄兔淚腺細胞凋亡因子Bax、Caspase-3、Fas和FasL的影響. 時珍國醫(yī)國藥, 2019(12): 2820-2822.

JIANG P F, QIN G Y, PENG X F, ZHANG Y W, PENG J, PENG Q H. Effects of Mimenghua granules on apoptosis factors bax, caspase-3, FasL in lacrimal gland cells of ovariectomized male rabbits. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2019(12): 2820-2822. (in Chinese)

[29] YANG W, COOKE M, DUCKETT C S, YANG X, DORSEY J F. Distinctive effects of the cellular inhibitor of apoptosis protein c-IAP2 through stabilization by XIAP in glioblastoma multiforme cells. Cell Cycle (Georgetown, Tex), 2014, 13(6): 992-1005. doi:10.4161/cc.27880.

[30] 吳夏夢, 劉進輝, 王英, 雷磊, 周展波, 王水蓮, 張虹亮. CRABP1過表達載體的構建及其對豬卵泡顆粒細胞凋亡的影響. 中國畜牧雜志, 2021(6): 172-177.

WU X M, LIU J H, WANG Y, LEI L, ZHOU Z B, WANG S L, ZHANG H L. Construction of CRABP1 overexpression vector and its effect on porcine granulosa cell apoptosis. Chinese Journal of Animal Science, 2021(6): 172-177. (in Chinese)

miR-221-3p Regulates Ovarian Granulosa Cells Apoptosis by TargetingSmall-Tail Han Sheep

1Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100193;2College of Life Science and Food Engineering, Hebei University of Engineering, Handan056001, Hebei

【】could promote apoptosis in mammals and is involved in the development of tissues and organs related to reproductive traits and in disease treatment. The aim of this study was to explore the effect of miR-221-3p on the regulation of granulosa cell apoptosis in Small-Tail Han sheep by targeting, so as to provide evidence for further study of the regulation ofgranulosa cell apoptosis and atresia of follicles.【】Based on the whole transcriptome sequencing analysis of the ovarian tissue of the previous study in our group, the differentially expressed geneand its regulatory element miR-221-3p were obtained in this study. Analysis of the expression ofdifferent tissues of the Small-Tail Han sheep by using semi-quantitative and tissue fluorescence quantification (RT-qPCR). The expression ofand miRNA-221-3p was identified in the ovarian tissues of the Small-Tail Han sheep in the follicular and luteal phase by RT-qPCR. The miR-221-3p mimic,wild-type andmutant-type were co-transfected in HEK293T cells with negative control, the dual luciferase reporter gene detection system was used to determine the targeting relationship between miR-221-3p and. The miR-221-3p mimic and negative control were transfected into ovarian granulosa cells to achieve the overexpression of miR-221-3p. RT-qPCR was used to detect the effect of miR-221-3p on the expression levels ofand the marker genes of the apoptosis of ovarian granulosa cell geneandat the mRNA level. At the same time, the changes in proliferation of granulocytes in the miR-221-3p overexpression and negative control groups were also analyzed using the EdU assay. 【】The results showed that the expression ofovarian tissue was the highest, followed by spleen and lung tissues. RT-qPCR results showed that the expression of miR-221-3p andwas significantly different in the ovarian tissues of Small-Tail Han sheep between follicular and luteal phases. The expression of miR-221-3p was higher in follicular than that in luteal phase ovaries, whereaswas less expressed in follicular than that in luteal phase ovaries, which showed the phenomenon of a negative regulation. Dual luciferase reporter analysis showed that overexpression of miR-221-3p significantly inhibited the activity of3’UTR vector (＜0.05). The overexpression of miR-221-3p significantly reduced the mRNA level expression of target gene, while follicular granulosa cell apoptosis expression of marker genesandwere also significantly reduced (＜0.05). Analysis of the EdU assay showed that the proliferation rate of granulosa cells overexpressing miR-221-3p was 18.9%, which was significantly higher than that of the negative control group at 10.43% (＜0.01). 【】and miR-221-3p were important genes and regulatory elements that regulate ovarian development in Small-Tail Han sheep.was one of the target genes of miR-221-3p, and overexpression of miR-221-3p could inhibit granulosa cell apoptosis by target.

miR-221-3p; Small-Tail Han Sheep; granulosa cells apoptosis;

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.09.015

2021-03-04；

2021-10-31

國家自然科學基金（32172704）、河北省自然科學基金青年項目（C2019402261）、國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術體系專項（CARS-38）、中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS13）

劉玉芳，E-mail：aigaiy@126.com。通信作者儲明星，E-mail：mxchu@263.net

（責任編輯 林鑒非）