張先茂，顏庭林

（甘肅省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，甘肅蘭州 730050）

DNA條形碼技術(shù)是近年來新興的DNA分子檢測技術(shù)[1]。不同于傳統(tǒng)的分子檢測技術(shù)，DNA條形碼以一對通用引物擴(kuò)增物質(zhì)的線粒體基因COI標(biāo)準(zhǔn)序列，通過序列內(nèi)堿基的多樣性對已知和未知的成分進(jìn)行識別，且這種技術(shù)已逐漸應(yīng)用于食品領(lǐng)域[2]。在動物源性食品中，線粒體基因COI已成為動物物種鑒定中公認(rèn)的理想DNA條形碼片段。由于DNA分子的熱穩(wěn)定性，DNA條碼技術(shù)在加工肉類食品中鑒定動物源性成分、標(biāo)簽符合性查驗(yàn)等方面被廣泛應(yīng)用[3-5]。

目前對肉類加工食品中未知動物源性成分的檢驗(yàn)還處于空白階段，傳統(tǒng)的Sanger測序技術(shù)僅能對已知動物源性成分進(jìn)行檢驗(yàn)，在對多種未知動物源性成分的檢驗(yàn)方面還存在不足。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DNA條碼技術(shù)，結(jié)合納米技術(shù)，開發(fā)能快速、準(zhǔn)確檢測食品中動物源性成分的檢驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

動物源性食品來源：熟制牛肉、熟制羊肉、熟制鴨肉、熟制雞肉、熟制豬肉和熟制牦牛肉購自蘭州某大型超市，-18 ℃保存；熟制馬肉購自甘南藏區(qū)。

1.2 試劑

動物源性成分DNA提取試劑盒（天根生物科技有限公司，包括DNA裂解液；PCR緩沖液 10X；dNTP 10X；Tap酶5 U/μL）；瓊脂 糖（Sigma）；GEL-Red（碧云天生物科技有限公司， 10000X）。

1.3 設(shè)備

PCR儀（美國伯樂，T100）；水平電泳儀（美國伯樂，PowrpacBasic）；凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂，GEL DOCXR）；熒光定量PCR儀（美國賽默飛，QuantStudio）；核酸蛋白測定儀（美國賽默飛，Nanodrop one）；組織破碎儀（格蘭迪森，GD-IN）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 引物探針設(shè)計(jì)

應(yīng)用PrimerBank，結(jié)合VALENTINI等[6]的方法，設(shè)計(jì)牛肉、羊肉、鴨肉、雞肉和豬肉的通用引物，引物探針序列如表1所示。

表1 引物探針序列

1.4.2 樣本DNA提取及質(zhì)量檢測

根據(jù)試劑盒說明書步驟提取動物源性食品樣品DNA。提取純化后的DNA溶液為10 μL，取0.2 μL到核酸蛋白測定儀中測定純度，核酸純度控制在70～120 ng/μL[7]。

1.4.3 高通量DNA條碼技術(shù)的建立

與賽默飛生物科技有限公司合作，將設(shè)計(jì)的通用內(nèi)參基因序列，F(xiàn)＇端通用引物，R＇端通用引物，探針引物固定在熒光實(shí)時定量PCR儀器配套的微流控芯片上。將純化后濃度為70～120 ng/μL的核酸，牛、羊、鴨、雞、豬DNA滴加在熒光實(shí)時PCR微流控芯片上[8]。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最終確定多重實(shí)時熒光PCR反應(yīng)最優(yōu)條件見表2。

表2 實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系

1.4.4 方法特異性及檢出限

取同樣質(zhì)量的牛、羊、鴨、雞、豬、馬和牦牛動物源性樣品，用組織破碎儀打碎，混勻，按照1.4.2的方法提取DNA，對混合樣品進(jìn)行多重實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增熒光曲線，檢測通用引物擴(kuò)增的特異性[9]。

將牛、羊、鴨、雞和豬的模板樣品的DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，原始DNA濃度為100 ng/μL，稀釋后濃度分別為10.00 ng/μL、1.00 ng/μL、0.10 ng/μL和0.01 ng/μL。多重實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增后，檢測牛、羊、鴨、雞和豬的模板樣品DNA的最低檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取質(zhì)量及純度檢測結(jié)果

按照1.4.2實(shí)驗(yàn)方法提取樣品中DNA，用核酸蛋白分析儀測定核酸濃度。如表3所示，所有樣品DNA提取效果較好，DNA濃度在150～270 ng/μL，需要對DNA濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋，控制DNA濃度在70～120 ng/μL。

表3 提取的DNA濃度

2.2 多重DNA條碼擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)通用引物和探針擴(kuò)增牛、羊、雞、鴨和豬樣品，通過優(yōu)化PCR條件，最終被檢測樣品均擴(kuò)增出明亮、無拖尾的特征性目的條帶，說明該方法可以同時檢測5種樣品，且無干擾條帶。擴(kuò)增出的片段，牛源性樣品為274 bp，羊源性樣品為331 bp，雞源性樣品為227 bp，鴨源性樣品為201 bp，豬源性樣品為398 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖1。

圖1 多重DNA條碼擴(kuò)增結(jié)果

2.3 特異性和檢出限檢測結(jié)果

在已知樣品中混入馬、牦牛動物源性物質(zhì)，根據(jù)多重動物源性樣品多重實(shí)時熒光擴(kuò)增結(jié)果，馬動物源性食品應(yīng)用通用引物擴(kuò)增，擴(kuò)增不出熒光條帶，說明該方法研究的通用引物具有特異性。如圖2所示，1號為空白，2號為馬肉，顯示無擴(kuò)增產(chǎn)物。3號、4號分別為牛、牦牛，說明該引物對同源相似性大的動物源性食品均有擴(kuò)增效果。5～8號分別為羊、雞、鴨、豬源性食品，均有很好的熒光擴(kuò)增曲線。取牛、羊、雞、鴨和豬的模板樣品，混合打碎后提取純化DNA，經(jīng)梯度稀釋后，混合樣品DNA濃度依次為100.00 ng/μL、10.00 ng/μL、1.00 ng/μL、 0.10 ng/μL和0.01 ng/μL。經(jīng)多重實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增后，結(jié)果如圖3所示，1號為DNA濃度100.00 ng/μL，2號 為DNA濃 度10.00 ng/μL，3號 為DNA濃 度 1.00 ng/μL，4號 為DNA濃 度0.10 ng/μL，5號 為DNA濃度0.01 ng/μL，6號為空白。DNA濃度為0.01 ng/μL時，無擴(kuò)增熒光曲線，表明DNA濃度過低，不能有效擴(kuò)增。最低DNA濃度為0.10 ng/μL時有熒光擴(kuò)增曲線，表明該方法能檢測到的最低DNA濃度為 0.10 ng/μL，該方法的檢出限為0.10 ng/μL。

圖2 樣品多重實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增曲線

圖3 樣品濃度梯度多重PCR擴(kuò)增曲線

3 結(jié)論

該方法研究應(yīng)用DNA分子標(biāo)記技術(shù)，開發(fā)通用引物探針，快速檢測牛、羊、雞、鴨和豬5種混合樣品中每類樣品的含量，該檢驗(yàn)方法能檢測DNA的最低濃度為0.10 ng/μL，方法檢出限為0.10 ng/μL，該靈敏度滿足國家標(biāo)準(zhǔn)檢測動物源性成分標(biāo)準(zhǔn)要求。