種 婷

（遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧沈陽 110032）

大腸菌群是一群革蘭氏陰性無芽孢桿菌，能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，一般用來作為食品是否受到糞便污染的衛(wèi)生指示菌[1]。糞便中可能含有腸道致病菌，如沙門氏菌、副溶血性弧菌和單核細胞增生李斯特氏菌等，食用受到糞便污染的食品具有潛在危害，所以大腸菌群檢測在食品微生物檢驗中具有重要意義[2]。

能力驗證是利用實驗室間比對，來評價實驗室檢測能力的一種重要方式[3]。本實驗室報名參加遼寧省市場監(jiān)督管理局組織的食品中大腸菌數(shù)計數(shù)能力驗證，按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù)》（GB 4789.3—2016）檢驗，2名檢驗員對同一質控樣品進行檢驗。通過參加能力驗證，提高本實驗室檢測人員的技術水平，加強實驗室質量控制，確保出具的檢測結果準確可靠。

1 材料與方法

1.1 樣品

遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)放的編碼為W033質控樣。在生物安全柜內將含有大腸菌群的西林瓶打開，加入少量（2～4 mL）無菌生理鹽水進行溶解，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，反復用余下的無菌生理鹽水清洗西林瓶內壁，回收無菌生理鹽水，并放入上述無菌瓶中，稀釋液合計40 mL，此溶液即為待測樣品。吸取待測樣品25 mL加入225 mL無菌生理鹽水中，充分溶解，均質混勻。

1.2 儀器與試劑

KB240型電熱恒溫培養(yǎng)箱（德國Binder公司）；BSC-1300ⅡA2型生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；CX31型顯微鏡（日本Olympus公司）；KG-SX-700高壓滅菌鍋（日本Tomy Kogoy公司）；均質器（法國梅里埃公司）；MICROFLEX LT/SH基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（德國布魯克公司）。

結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（Violet Red Agar，VRBA）、煌綠乳糖膽鹽（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）、肉湯（美國BD公司）；伊紅美藍瓊脂（Eosin-Methylene Blue Agar）、革蘭氏染色液試劑盒（北京陸橋技術股份有限公司）；氯化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA）（德國Bruker公司）。

1.3 試驗方法

依據(jù)作業(yè)指導書以及《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù)》（GB 4789.3—2016）第二法大腸菌群平板計數(shù)法，2名檢驗員同時進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 可疑菌落計數(shù)

VRBA平板上有3種菌落形態(tài)，各不同菌落形態(tài)見表1。不同菌落形態(tài)的菌落數(shù)見表2。

表1 VRBA平板上菌落形態(tài)

表2 VRBA平板不同形態(tài)菌落計數(shù)

2.2 確證試驗

選取1∶10和1∶100稀釋度VRBA平板上各10個不同類型典型和可疑菌落，接種至BGLB肉湯管中，36 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察產(chǎn)氣情況，結果見圖1，凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性（+），結果見表3。為了確保結果準確可靠，將典型菌落和可疑菌落分別接種至EMB平板，同時革蘭氏染色鏡檢觀察，結果分別見圖2和圖3。

圖1 典型菌落和可疑菌落在BGLB肉湯中生長情況

表3 確證試驗BGLB肉湯結果

圖3 革蘭氏染色鏡檢結果

2.3 樣品結果報告

經(jīng)證實，大腸菌群陽性的試管比例乘以相應稀釋度VRBA平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每mL樣品中大腸菌群結果，因此樣品W033結果報告為 3 600 CFU/mL。

3 結論與討論

GB 4789.3—2016標準中第一法MPN計數(shù)適用于檢測大腸菌群含量較低的食品；第二法平板計數(shù)法適用于檢測大腸菌群含量較高的食品，本次試驗采取平板計數(shù)法進行檢驗[4]。平板計數(shù)法用結晶紫中性紅膽鹽培養(yǎng)，分2次傾注平板。第1次傾注平板時要有一定的厚度，給細菌提供充足的營養(yǎng)。第2次傾注平板，能防止細菌蔓延生長；降低需氧菌生長速度；截留大腸菌群產(chǎn)生的氣體，觀察產(chǎn)氣 情況。

BGLB發(fā)酵管有明顯不同，可疑菌落接種的BGLB肉湯管培養(yǎng)24 h無變化，培養(yǎng)至48 h時，不僅產(chǎn)氣，而且BGLB肉湯變黃。為了確證該菌是否屬于大腸菌群，將產(chǎn)氣不變色和產(chǎn)氣變黃的BGLB肉湯均劃線接種至EMB平板，36 ℃培養(yǎng)24 h，產(chǎn)氣不變色的BGLB肉湯劃線接種在EMB平板上生長的菌落具有大腸桿菌的典型特征，紫黑色菌落，帶有綠色金屬光澤。產(chǎn)氣變黃的BGLB肉湯劃線接種在EMB平板上生長的菌落呈現(xiàn)淡粉色，表面濕潤。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢VRBA平板上生長的3種不同形態(tài)的菌均為革蘭氏陰性桿菌。采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜對3種菌進行快速鑒定，鑒定結果顯示典型菌落1為大腸桿菌（分值2.235），典型菌落2為大腸桿菌（分值2.367），可疑菌落3為克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌，分值2.286）。克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）屬于腸桿菌屬，其特征符合大腸菌群的定義，故其數(shù)量應計算在結果中[5]。

參加能力驗證時應注意：①運輸過程中溫度控制是否達標，溫度波動過大，對計數(shù)型質控樣菌數(shù)有較大影響；②收到樣品后要第一時間冷藏保存，若冷凍保存，易導致結果異常；③樣品在水化前是否使樣品恒溫到室溫，若快速升溫易造成細胞破裂，導致結果出現(xiàn)偏差[6]；④均質時間要適宜，若均質時間過短，冷凍干燥的樣品溶解不充分，其中的菌體團沒有完全分散開，易造成結果偏低；⑤應在 15 min內完成試驗，操作時間過長會導致菌體死亡，導致結果偏低。

經(jīng)能力驗證組織機構反饋，本實驗室W033大腸菌群的檢測結果|Z|＜2，結果滿意[7]。本次能力采取人員比對來減小操作誤差，以確保檢測結果可靠。2名檢驗員檢測結果基本一致，說明本次能力驗證基本無人為誤差。本次能力驗證所用的培養(yǎng)基及試劑均經(jīng)過《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質量要求》（GB 4789.28—2013）驗證，符合試驗要求。通過本次能力驗證，可提高本實驗室大腸菌群檢測能力以及本實驗室的競爭力。