盧譽之，閆婧宇，易汪兮月，李瑩瑩，盛紅坤

（南開大學(xué)濱海學(xué)院，天津 300270）

隨著工業(yè)化進(jìn)程的加速，人類的工業(yè)活動，例如礦產(chǎn)開采、污染超標(biāo)空氣持續(xù)排放、大量使用化肥和含重金屬材料，造成鉛、銅、鎘和鎳等毒性較大的重金屬元素及其合成物進(jìn)入環(huán)境各圈層中。生長于重金屬污染環(huán)境中的動植物以及微生物不斷被迫吸收重金屬，隨著時間的推移和營養(yǎng)級在食物鏈中的升高，重金屬物質(zhì)在食物鏈上層的生物體中的濃度也逐漸升高[1-4]。在修復(fù)重金屬污染過程中，最常用到的是微生物修復(fù)，其中植物根際微生物起到了很大的作用。微生物通過與重金屬絡(luò)合、吸附、氧化和還原等反應(yīng)后，改變了重金屬在土壤中的移動方向以及存在形態(tài)，很大程度上降低了重金屬活性或毒性，起到修復(fù)土壤的作用。

1 微生物對重金屬元素的耐性機(jī)制

1.1 離子交換

重金屬離子在細(xì)胞外不能產(chǎn)生任何毒害作用，只有進(jìn)入細(xì)胞后才能產(chǎn)生作用。大部分細(xì)胞對重金屬元素有兩種吸收系統(tǒng)：一種是快速的，不依賴單一底物運載，主要靠細(xì)胞內(nèi)外離子濃度差進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；另一種是慢速的，以ATP水解產(chǎn)生的能量作為運載物，通常只有細(xì)胞急需時才使用[5]。XIONG等[6]通過對比酸性和堿性介質(zhì)中硫酸交聯(lián)褐藻（CAS）吸附Re（Ⅶ）前后的傅里葉變換紅外光譜，提出離子交換是酸性條件中CAS吸附Re（Ⅶ）的主要原理作用。吳娟和李清彪[7]研究發(fā)現(xiàn)，在試驗開始前，Pb2+溶液中Ca2+、Mg2+的濃度為0 mg/L，反應(yīng)后Ca2+和Mg2+的濃度分別變成0.13 mg/L和0.21 mg/L，說明黃孢原毛平革菌可利用離子交換的方式吸收Pb2+。

1.2 氧化還原

氧化還原作用是微生物處理重金屬元素過程中重要的解毒作用。勞昌玲等[8]將制革廢液中篩選出的蠟樣芽孢桿菌接種于含鉻溶液中，可以觀察到Cr6+濃度減少，Cr3+濃度增多，毒性明顯降低；游離態(tài)的Au毒性很強，是因為游離態(tài)Au極易與生物細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽結(jié)合，進(jìn)而抑制相關(guān)酶的活性，單質(zhì)Au卻對微生物基本沒有毒害作用；Au離子在不同的微生物細(xì)胞中反應(yīng)機(jī)制各不相同，微生物可通過酶、分泌物等化學(xué)物質(zhì)還原Au離子，起到解毒的作用。

1.3 重金屬積累與溶解

微生物對重金屬積累的作用方式有官能團(tuán)吸附、細(xì)菌胞外復(fù)合物、鐵介質(zhì)和金屬鹽類反應(yīng)[9]。此外，富集作用與上述方法都有所不同，富集作用是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的主動運輸過程，是重金屬離子從細(xì)胞外借助蛋白質(zhì)載體，穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的過程[10]。微生物對重金屬的溶解常見于各種代謝活動，在生長過程中，微生物會通過自主生理代謝產(chǎn)生很多有機(jī)物，這些有機(jī)物能與重金屬結(jié)合，使重金屬較易溶解[8]。1986年，PATTERSON和PASSINO提出細(xì)菌可以通過自身產(chǎn)出有機(jī)物質(zhì)溶解重金屬或含重金屬的礦物質(zhì)[11]。

1.4 酶促作用

依據(jù)微生物細(xì)胞的活性程度，可以分為非活性細(xì)胞和活性細(xì)胞，兩種都能夠吸附重金屬離子。其中，細(xì)胞上某些酶的活性很可能對活性生物細(xì)胞吸收金屬離子的能力有影響。如HOLAN等[12]研究活性啤酒酵母對Cd2+吸附情況時發(fā)現(xiàn)，鎘的磷酸鹽沉淀物在細(xì)胞的液泡中大量存在，因此認(rèn)為在細(xì)胞培育過程中加入“磷酸供體”后所產(chǎn)生的磷酸酶，是Cd2+進(jìn)入細(xì)胞時所需的酶。微生物吸附重金屬離子時所涉及到的酶促反應(yīng)機(jī)理種類繁多，雖然很多專家致力于此領(lǐng)域，但至今還未有一個完整且詳細(xì)的理論體系可以說明該反應(yīng)機(jī)理。

2 重金屬耐性微生物的分離篩選

2.1 耐鎘微生物的分離篩選

田振華[13]采用Cd2+濃度馴化法從鎘污染土壤中篩選出一株曲霉屬真菌，耐鎘濃度達(dá)20 mg/kg。徐婷婷[14]采用澆注平板法從錳礦附近的土壤中篩選出一株棘孢曲霉，耐鎘濃度為20 mg/L。李輝[15]采用劃線純化法從Pb、Cd污染的土壤中篩選出一些耐鎘的菌株，細(xì)菌有葡萄球菌屬、黃桿菌屬、摩根氏菌屬和檸檬酸菌屬等，真菌有根霉屬、鐮刀菌屬、釀酒酵母屬和頭孢霉屬等；所有菌株在含鎘濃度為250 mg/L的培養(yǎng)基上長勢較好。劉愛民[16]采用平板直接分離耐鎘細(xì)菌的方法，從鎘污染土壤表層中篩選得到一株假單胞菌，耐鎘濃度為40 mmol/L。

2.2 耐鉛微生物的分離篩選

張璐等[17]采用劃線純化法從尾礦區(qū)土壤中篩選出兩株菌株，G-1為芽孢桿菌屬，G-2為克雷伯菌，分別可以在Pb2+為2 000 mg/L的培養(yǎng)基中生長。闞洪媛等[18]采用濃度馴化法從某煤矸石土壤中篩選出一株蠟狀芽孢桿菌，其耐Pb2+質(zhì)量濃度為800 mg/L。李輝等[15]使用劃線純化法從Pb、Cd污染的土壤中篩選出一些耐鉛菌株，鑒定為動性球菌屬、節(jié)桿菌屬、葡萄球菌屬等，真菌初步鑒定為根霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬等。

2.3 耐鎳微生物的分離篩選

賈成光等[19]采用平板直接篩選法從二沉池污泥中分離出一株寡養(yǎng)單胞菌，是一株耐鎳濃度為400 mg/L的革蘭氏陰性菌。曲媛媛等[20]采用濃度梯度篩選法，從二沉池污泥中得到一株耐鎳100 mg/L的腸桿菌。蘭曉君等[21]采用稀釋涂布法從金川鎳礦中篩選出一些菌株，這些菌株分屬于4大類11個屬14個分類單元，其中38株屬于放線門，12株屬于厚壁菌門，3株屬于變形菌門α亞群，2株屬于變形菌門γ亞群；其中，最小抑制濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）最高為 20 mmol/L。

2.4 耐鉻微生物的分離篩選

何元等[22]采用篩選、馴化法從鉻污染的環(huán)境中得到一株沙雷氏菌，可以在1 000 mg/L 含鉻培養(yǎng)基中正常生長。李靜等[23]采用劃線純化法從攀枝花礦區(qū)植物根際土中分離出一株鏈霉菌，可在Cr4+濃度達(dá)到1 000 mg/L時生存。李政紅等[24]通過耐鉻菌富集的方法，在某皮革廠垃圾堆、污灌渠底泥收集的富含鉻污染的土壤樣品中篩選出一株無色桿菌，pH5.5～8.5、30 ℃為其最佳生長環(huán)境。

2.5 耐銅微生物的分離篩選

魯陳等[25]采用涂布平板法從含銅土壤中篩選出兩株長勢較好的菌株——FT5和FT7，分別為青霉菌和黑曲霉菌，耐受濃度為1 000 mg/L。劉婷婷等[26]采用平板稀釋法從銅污染土壤中篩選出一株放線菌，耐銅濃度最大為8 000 mg/L。盧福芝等[27]采用涂布平板法從重金屬污染的土壤中篩選出一株根霉菌，耐銅濃度達(dá)到30 mmol/L。張小菲等[28]采用稀釋涂布法從含銅的土壤樣品中篩選出一株節(jié)桿菌，最大耐銅質(zhì)量濃度為100 mg/L。

上述5種重金屬元素耐性微生物的分離篩選信息見表1。

表1 耐重金屬微生物的篩選

3 影響微生物修復(fù)土壤重金屬污染的因素

3.1 pH

生物體表面有吸附作用的金屬位點會受到pH的影響，也會進(jìn)一步影響金屬離子的化學(xué)狀態(tài)。當(dāng)pH很低時，溶液中含有大量的H+，與生物體表面的金屬吸附位點發(fā)生反應(yīng)，阻礙了重金屬離子與金屬吸附位點的結(jié)合，吸附作用受到抑制。當(dāng)pH緩慢升高時，溶液中H+濃度減少，微生物細(xì)胞表面重金屬吸附位點變多，更有利于金屬離子與金屬吸附位點的結(jié)合，但pH超過某一限值時吸附效率又會降低[15]。GIRI等[29]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH在2.5～7.5時，蠟樣芽孢桿菌吸收砷的效率隨著pH的升高而增大；pH超過7.5時，吸收效率逐漸降低。

3.2 吸附時間

重金屬離子的生物吸附可分為兩個階段。第一個是快速吸附階段，因為細(xì)胞表面有很多可以與重金屬離子結(jié)合的吸附點；第二個則是慢速吸附階段，這一階段中隨著細(xì)胞表面吸附點的減少，反應(yīng)速率也隨之減少。李明春等[30]研究啤酒酵母菌吸附Cu2+、Cd2+、Ni2+這3種重金屬離子的吸附程度發(fā)現(xiàn)，這3種重金屬被吸附反應(yīng)速度都快，在1 h內(nèi)Cu2+的吸附量最多。

3.3 重金屬濃度

重金屬離子吸附過程中，重金屬離子的濃度起到了重要的作用。重金屬離子濃度升高，微生物的吸附量也增大，與吸附時間機(jī)制相同，當(dāng)重金屬離子濃度很高的時候，吸附量反而會降低。將吸附量最大時的重金屬離子濃度，定義為吸附飽和濃度。當(dāng)細(xì)胞表面的吸附點有限時，隨著溶液中重金屬離子濃度的增大，吸附點逐漸減少，其反應(yīng)效率也逐漸降低。

3.4 化學(xué)預(yù)處理

借助加熱、降溫等預(yù)處理方法，對具有生物吸附性能的材料進(jìn)行處理，使吸附性質(zhì)發(fā)生變化的過程稱為化學(xué)轉(zhuǎn)化。經(jīng)過處理的生物吸附材料可出現(xiàn)較多的吸附位點，吸附位點的增多使吸附效率得到大幅度提升。吳娟等[31]研究白腐真菌吸附鉛的機(jī)理發(fā)現(xiàn)，NaOH處理過的菌體吸附能力顯著提高；在NaOH濃度為0.1 mol/L時，白腐真菌對鉛的吸附量最大；可能是因為細(xì)胞中的部分雜質(zhì)被氫氧化鈉溶解從而暴露出更多的位點，進(jìn)而增大了對重金屬離子的吸附量。

3.5 溫度

從理論上講，重金屬的吸附能力會隨著溫度的升高而增加，但不同的生物吸附材料可以承受的溫度不同，有些微生物耐受溫度范圍較廣，但有些微生物耐受溫度范圍較小，從而受溫度影響程度大，溫度過高或過低都會影響吸附效率。張敬華等[32]研究啤酒酵母吸附Pb2+機(jī)制發(fā)現(xiàn)，在同一Pb2+質(zhì)量濃度下，隨著溫度的升高，啤酒酵母吸附Pb2+的速率逐漸增加。

3.6 共存離子

工業(yè)廢水中包含了各種各樣的重金屬離子，這些金屬離子與所研究的重金屬離子形成競爭關(guān)系，占據(jù)細(xì)胞表面的活性位點，從而導(dǎo)致吸附效率降低。干擾離子也會對試驗離子產(chǎn)生一定的影響，與試驗離子發(fā)生相互作用，進(jìn)而影響吸附效率。?；鄣萚33]發(fā)現(xiàn)，在pH值為4.5的條件下，含有Zn2+、Cd2+、Cu2+或As3+等離子的鉛污染廢水中，Cu2+、As3+對Pb2+吸附量沒有影響，Cd2+使Pb2+吸附量增加，而Zn2+使Pb2+吸附量減少。

3.7 其他因素

除上述因素外，還有很多其他因素也會對生物吸附造成影響。如金屬離子適應(yīng)吸附劑的能力、活性菌株存活時間、營養(yǎng)元素多樣性、吸附劑微粒的粒徑等，這些因素都會導(dǎo)致生物吸附效率有一定的變化。在實際使用過程中，首先需要明確合適的條件和方法，這樣才能使吸附效率達(dá)到最大[15]。

4 結(jié)語

耐重金屬微生物菌株的分離篩選主要影響因素是培養(yǎng)基和篩選方法，菌株的最大耐受濃度可以通過直接觀察菌種形態(tài)特征確定。耐性菌株的抗性機(jī)理主要是通過離子交換、氧化還原、酶促反應(yīng)以及與重金屬離子的相互作用降低對微生物的毒害作用。在研究微生物修復(fù)土壤重金屬污染的影響因素時，除了單因素的影響外，多個因素間的相互作用也應(yīng)受到重視。因此，在以后耐重金屬微生物篩選和修復(fù)土壤重金屬污染的影響因素研究中，要更加注重多種因素相互作用的影響和研究，以能夠高效分離得到耐性新菌株、全面提高修復(fù)效率。