譚 穎 張 超 魏夢娜 李 賀

1 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東 煙臺 264003；2 濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院胃腸外科 山東 煙臺 264100

胃癌(gastric cancer，GC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居惡性腫瘤的第三位[1]，全球每年有近70萬人死于GC。免疫細胞浸潤與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。中性粒細胞是從骨髓造血干細胞發(fā)育而來的一種具有活躍的變形運動和吞噬功能的白細胞，占白細胞總數(shù)的50%～70%，保護機體抵御病原微生物的入侵，并在非特異性細胞免疫中發(fā)揮重要作用。腫瘤相關(guān)中性粒細胞(tumorassociated neutrophils，TANs)是浸潤到腫瘤微環(huán)境中的中性粒細胞，是炎癥微環(huán)境的主要組成部分。TANs是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵細胞[2-3]，其與癌癥的侵襲、發(fā)展及預(yù)后高度相關(guān)。TANs已經(jīng)在多種類型的人類腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，包括頭頸部鱗狀細胞癌、結(jié)直腸癌和腎細胞癌[4-7]。TANs在乳腺癌和腎癌中的浸潤可以減少肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生，其機制為乳腺癌細胞中的TANs釋放CCL2，后者促進活性氧(reactive oxygen species,ROS)的分泌，產(chǎn)生細胞毒性作用，而腎癌細胞則是通過產(chǎn)生IL-8聚集TANs抑制腫瘤的進展轉(zhuǎn)移[8]。TANs在肝癌細胞系中通過分泌BMP2和TGF-β上調(diào)肝癌細胞中miR-301-3p的表達來增加其干細胞特性[9]。TANs被認為是腫瘤治療的真正靶點[10]，而其在GC中的存在和意義尚不清楚。

TANs的胞質(zhì)和胞膜上均有CD66b表達。作為TANs的生物學(xué)標(biāo)志，CD66b的陽性與否反映了腫瘤實質(zhì)中TANs的浸潤情況。而CD11b則是髓系細胞成熟的重要標(biāo)志物，CD11b+的腫瘤浸潤抗原遞呈細胞與GC相關(guān)[11-12]。本研究擬檢測CD11b+/CD66b+TANs亞群在GC中的表達情況，揭示CD11b+的TANs與GC患者年齡、性別、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Laruen分型、腫瘤大小、浸潤深度等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 GC標(biāo)本組織芯片(IWLT-N-114G71)購自上海芯超生物科技有限公司GC組織芯片庫，包含GC38例114點，每例取3點(胃癌1點，正常胃組織1點，轉(zhuǎn)移灶1點)。組織芯片的每個點都經(jīng)過病理診斷，手術(shù)時間為 2015年1月至2015年7月。兔抗人CD11b單克隆抗體(Abcam，ab52478，1∶500)，兔抗人CD66b多克隆抗體(Abcam，ab197678，1∶500)，抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒(基因科技，GK500705，1:150)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.2 免疫組化方法 將GC組織芯片在58℃烤片2 h，脫蠟、水化、抗原修復(fù)(PBS 洗滌 3 次后滴加3%過氧化氫，胎牛血清封閉30 min)。組織芯片與一抗CD11b、CD66b(1∶500)孵育，4℃過夜，然后與二抗(1∶150)孵育室溫1 h，水洗后用DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照。通過染色強度和陽性細胞率定量分析GC組織、正常胃組織以及轉(zhuǎn)移灶組織中CD11b+/CD66b+TANs的浸潤情況。染色強度為：0為陰性，1為弱陽性，2為陽性，3為強陽性。陽性細胞率為：0～5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，75%～100%為4分。免疫組織化學(xué)評分=染色強度×陽性細胞率。本研究將評分<3分歸入低表達組，評分≥3分歸入高表達組。CD11b、CD66b評分均≥3分判定為CD11b+/CD66b+TANs。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析處理。定性資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD11b+/CD66b+TANs在GC組織中的浸潤程度 免疫組化顯示，CD11b和CD66b主要表達于細胞質(zhì)(圖1)。圖1是隨機選取在GC組織及正常胃組織芯片中的CD11b+/CD66b+TANs的表達情況。38例GC組織芯片中，63.2%(24/38)的GC組織中CD11b和CD66b呈高表達，而23.7%(9/38)的鄰近正常胃組織中CD11b和CD66b呈高表達，兩者比較，P<0.001(表1)。

表1 CD11b+/CD66b+TANs在組織芯片中的表達情況

2.2 CD11b+/CD66b+TANs在GC原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中的分布情況免疫組化結(jié)果顯示，入組患者中GC組織、轉(zhuǎn)移癌組織中TANs的CD11b、CD66b的蛋白表達明顯高于正常胃組織(圖2)。這提示，CD11b+/CD66b+TANs在GC原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中廣泛浸潤。

2.3 CD11b+/CD66b+TANs表達與GC臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性比較 兩組間臨床資料的特點，不同性別、Lauren分級的患者與GC組織中 CD11b+/CD66b+TANs表達量，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。CD11b+/CD66b+TANs隨GC患者的年齡(P=0.008)、組織學(xué)分級(P=0.028)、腫瘤大小(P=0.001)的上升表達量增加。CD11b+/CD66b+TANs表達水平增加的GC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.009)的風(fēng)險增高(表2)。

A. CD11b+細胞在GC中呈高表達(Scores≥3)；B. CD11b+細胞在GC中呈低表達(Scores<3)；C. CD11b+細胞在正常胃組織中呈高表達(Scores≥3)；D. CD11b+細胞在正常胃組織中呈低表達(Scores<3)；E. CD66b+細胞在GC中呈高表達(Scores≥3)；F. CD66b+細胞在GC中呈低表達(Scores<3)；G. CD66b+細胞在正常胃組織中呈高表達(Scores≥3)；H. CD66b+細胞在正常胃組織中呈低表達(Scores<3)。

A. 免疫組化結(jié)果顯示GC組織以及轉(zhuǎn)移組織中的CD11b的蛋白表達情況明顯高于其癌旁正常組織中的表達；B. 免疫組化結(jié)果顯示GC組織以及轉(zhuǎn)移組織中的CD66b的蛋白表達情況明顯高于其癌旁正常組織中的表達。

表2 CD11b+/CD66b+TANs表達與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性(n=38)

3 討論

GC是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。近年來，隨著人們生活方式和飲食習(xí)慣的改變，GC的發(fā)病率逐年上升，給家庭和社會帶來了沉重的負擔(dān)。GC發(fā)病隱匿，侵襲性較強，大部分患者就診時已出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移[12]。目前針對GC的治療方式主要以手術(shù)或放療/化療為主，在術(shù)后易復(fù)發(fā)且5年生存率較低。隨著分子生物學(xué)研究的進展，腫瘤的分子靶向治療已成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點。近年來越來越多的研究認為GC的免疫治療是一個新的突破口，例如，在GC組織中呈高表達的PD-L1已經(jīng)成為GC免疫治療較為成熟的生物標(biāo)志物[13]。

髓系細胞廣泛參與了腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶的形成和進展。CD11b在髓系細胞中呈高表達，參與調(diào)節(jié)造血和髓系細胞形成過程[14]，隨著造血細胞的分化，其表達逐漸增加[15]。大量CD11b+髓系細胞的浸潤使腫瘤的生長受到明顯抑制，一些轉(zhuǎn)移灶體積縮小甚至消失[16-17]。CD11b+腫瘤浸潤抗原遞呈細胞的浸潤程度與腫瘤體積、靜脈浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期顯著相關(guān)。CD11b+腫瘤浸潤抗原遞呈細胞浸潤程度高的患者比浸潤程度低的患者手術(shù)效果差，提示CD11b+細胞浸潤是GC的獨立預(yù)后因素之一[18]。CD11b/CD18促進miR-let7a依賴的促炎性巨噬細胞轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控巨噬細胞極化，調(diào)節(jié)新生血管形成，促進小鼠和人類癌癥模型中的抗腫瘤免疫反應(yīng)[19-20]。

目前關(guān)于腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)與GC大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期的相關(guān)性已經(jīng)被研究證實，但是對于TANs的研究仍然較少。TANs可被活化成具有抗腫瘤效應(yīng)的N1型和具有促腫瘤效應(yīng)的N2型。干擾素-β可以促進中性粒細胞極化為N1型，轉(zhuǎn)化生長因子-β可誘導(dǎo)TANs向N2型極化[21]。N1型TANs可通過增加腫瘤微環(huán)境中的ROS及腫瘤壞死因子殺傷腫瘤，而N2型TANs則可以通過集落刺激因子，趨化因子、機制降解酶等促進腫瘤的生長。目前，N1型和N2型TANs的分類和標(biāo)志物尚不清楚。

CD66b僅在中性粒細胞中表達，其作為目前臨床公認的TANs標(biāo)志物可以用來監(jiān)測腫瘤實質(zhì)中的TANs數(shù)量。Yamashita等[22]研究表明，CD66b的表達在浸潤性乳腺癌擴散組中明顯高于無擴散組，并且侵襲性亞組的生存率更低。Zhi等[23]研究表明，CD66b表達的升高與GC的腫瘤侵襲性特征相關(guān)。但也有研究表明，TANs可被GM-CSF和IFN-γ活化，增強T細胞的抗腫瘤作用[23]。因此，TANs在腫瘤中的分布和作用尚存在爭議。而關(guān)于CD11b和CD66陽性的TANs亞群在GC中的作用未見于報道。

本研究觀察了GC組織芯片中CD11b+/CD66b+TANs的浸潤情況，發(fā)現(xiàn)CD11b+/CD66b+TANs在GC原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中廣泛浸潤，與GC患者的年齡、組織學(xué)分級、腫瘤大小呈正相關(guān)，CD11b+/CD66b+TANs表達水平較高患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增高，推測該類細胞亞群可能屬于N2型腫瘤相關(guān)中性粒細胞，參與促進GC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，GC中存在大量的中性粒細胞浸潤情況，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。CD11b+/CD66b+細胞的浸潤情況有望成為預(yù)測GC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的潛在指標(biāo)。關(guān)于CD11b+/CD66b+TANs通過何種機制作用于腫瘤細胞將是后續(xù)的研究重點。