高 松，陳安林，黃 健，喻安永，夏靈尹，閔 迅

(1. 遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，貴州 遵義 560003； 2. 遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院急診科，貴州 遵義 560003； 3. 遵義醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院，貴州 遵義 563000)

創(chuàng)口鮑特菌(Bordetellatrematum)屬于鮑特菌屬，是一種革蘭陰性短小桿菌。鮑特菌屬包含的種類較多，其中最常見的是百日咳鮑特菌和副百日咳鮑特菌[1]。創(chuàng)口鮑特菌為專性需氧菌，營養(yǎng)要求不高，在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長良好。Vandamme等[2]在1996年首次報道創(chuàng)口鮑特菌，并將其歸類為鮑特菌屬細菌中的一種。作為條件致病菌，其廣泛存在于自然環(huán)境中。創(chuàng)口鮑特菌主要引起創(chuàng)面皮膚和軟組織感染，也有報道從患者下呼吸道、耳分泌物和血液中分離到此菌。若治療不及時，可引起嚴重的血流感染，導致膿毒血癥，威脅患者生命[3]。目前，國內尚無關于創(chuàng)口鮑特菌感染的病例報道。1例上肢外傷患者傷口分泌物分離菌株，經生化鑒定、質譜鑒定，以及16S rRNA基因序列分析鑒定為創(chuàng)口鮑特菌，現(xiàn)將其臨床特點和微生物特征報告如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)、VITEK MS全自動快速微生物質譜檢測系統(tǒng)、陽性球菌鑒定卡、CHCA基質液均購自法國生物梅里埃公司,快速革蘭染色液購自珠海貝索公司，血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基均購自貝瑞特公司，細菌基因組提取試劑盒購自北京天根公司，PCR擴增試劑、DNA Maker購自TaKaRa公司(上海生物技術股份有限公司),16S rRNA引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 分離培養(yǎng) 無菌棉拭子蘸取患者創(chuàng)面分泌物，采用分區(qū)劃線法接種于血平板和麥康凱平板。置于36℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，觀察細菌生長情況。

1.2.2 顯微鏡觀察 挑取適量單個菌落，與適量生理鹽水在載玻片上混勻，制成涂片，革蘭染色后油鏡觀察。

1.2.3 生化鑒定 挑取麥康凱平板上單個純菌落，制成0.5麥氏單位的菌懸液。選擇革蘭陰性桿菌鑒定卡(GN),根據(jù)全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK 2 Compact操作說明書進行上機鑒定。

1.2.4 質譜鑒定 取適量待測菌均勻涂抹于全自動快速微生物質譜檢測系統(tǒng)VITEK MS配套靶板上，加1 μL的質譜樣品處理基質液覆蓋菌膜，以大腸埃希菌E.coli8739為質控菌株，待基質液干燥后上機檢測。

1.2.5 分子生物學鑒定 使用全自動核酸提取儀制備細菌基因組DNA。采用16S rRNA通用引物正向引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；反向引物：ACGGCTACCTTGTTACGACTT進行PCR擴增。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴增產物送上海生工生物公司進行測序，并在NCBI網站進行序列比對分析。

1.2.6 藥敏試驗 采用最低抑菌濃度(MIC)法進行藥物敏感性檢測。制備0.5麥氏單位菌懸液，根據(jù)革蘭陰性菌藥敏卡(GN09)要求進行稀釋，然后使用VITEK 2 Compact儀器進行藥敏試驗。試驗結果根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI) M100抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準2020版進行判讀。

2 結果

2.1 病例資料 患者，男性，44歲，既往身體健康。2020年8月因工作時被機器絞傷致右上肢疼痛、流血伴活動受限到遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院急診科就診，初步診斷為“右上肢機械性絞傷”。急救創(chuàng)傷病房住院，經骨科醫(yī)生施行右肘關節(jié)脫位復位+右尺骨骨折克氏針內固定術+右上肢外固定術，整形外科醫(yī)生施行右上肢擴創(chuàng)+血管、神經探查+異物清除+得膜建覆蓋創(chuàng)面+手背擴創(chuàng)+VSD安置術。術后病情平穩(wěn)，囑患者帶外固定架出院休養(yǎng)，后期復查后再行后續(xù)治療。

2020年11月患者因“右上肢外固定術2+月，返院行內固定術”。在全麻下行“右尺骨近端骨折切開復位內固定術+尺橈關節(jié)畸形愈合松解術”，術后予以抗感染、補液、止痛、換藥、促進創(chuàng)面愈合等對癥治療。兩周后臨床醫(yī)生檢查發(fā)現(xiàn)其右上肢上段手術創(chuàng)面未愈合，手術創(chuàng)面紅腫并且覆著膿性分泌物?；颊咦栽V術區(qū)疼痛，偶感惡心、嘔吐，無畏寒及發(fā)熱，無胸悶、氣促及呼吸困難，精神、飲食及睡眠可，大小便正常。實驗室檢查結果：血常規(guī)檢查白細胞和血小板計數(shù)正常，紅細胞4.03×1012/L,血紅蛋白110 g/L,白細胞介素-6 82.5 pg/mL,降鈣素原(PCT) 0.45 ng/mL、C-反應蛋白(CRP) 36.2 mg/L，結果均提示患者可能并發(fā)術后感染。經兩次引流、清創(chuàng),以及更換抗生素抗感染治療，手術創(chuàng)面逐漸好轉后出院，但仍有少許滲出，囑患者院外加強換藥。

2.2 微生物學檢查

2.2.1 菌落特征及鏡下形態(tài) 患者創(chuàng)面分泌物培養(yǎng)24 h后，觀察發(fā)現(xiàn)血瓊脂培養(yǎng)基上有圓形、干燥、粗糙大小不等的乳白色菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上有淡粉紅色、點狀、干燥、針尖樣大小的菌落。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后觀察發(fā)現(xiàn)血平板上的菌落呈扁平、干燥、表面粗糙、不規(guī)則、較大的乳白色菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上長成較小的淡粉紅色、圓形菌落。見圖1。革蘭染色，油鏡下觀察見革蘭陰性桿菌，中等大小。見圖2。

2.2.2 生化鑒定 采用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)及其配套GN鑒定卡對細菌進行全面生化鑒定，見表1。經VITEK 2 Compact AES高級專家系統(tǒng)進行比對，鑒定結果為鮑特菌屬(置信度為97%)。

表1 患者創(chuàng)面分泌物分離細菌VITEK 2 Compact生化試驗鑒定結果

2.2.3 質譜鑒定 VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)未能將此菌鑒定到種，進一步采用微生物質譜儀進行鑒定。經VITEK MS鑒定結果為創(chuàng)口鮑特菌(置信度為99.9%),其在2 066、4 329、5 209、5 249、6 304、6 713 M/z處有特征峰譜，見圖3。

2.2.4 16S rRNA鑒定 經瓊脂糖凝膠電泳檢測確證擴增成功，PCR擴增產物長度為1 500 bp。將擴增產物送測序，測序結果進行BLAST比對分析。比對發(fā)現(xiàn)其與創(chuàng)口鮑特菌的同源性為99.9%。見圖4。

表2 創(chuàng)口鮑特菌對常用抗菌藥物的藥敏結果

3 討論

鮑特菌屬包含多個菌種，最常見的是百日咳鮑特菌和副百日咳鮑特菌。創(chuàng)口鮑特菌感染在臨床上極為少見，主要見于創(chuàng)面感染，尤其是經久不愈的傷口或潰瘍。查閱文獻發(fā)現(xiàn)最近幾年也有少量的文獻報道。2020年Kukla等[4]報道在1例肺癌患者的呼吸道標本中分離鑒定出1株創(chuàng)口鮑特菌。2019年Castro等[5]報道在1例74歲女性患者的腿部潰瘍和壞疽組織中分離培養(yǎng)出創(chuàng)口鮑特菌。此外，2016年Majewski等[3]在膿毒癥患者血液中分離鑒定出創(chuàng)口鮑特菌，說明此菌不僅可以引起創(chuàng)面感染和呼吸道感染，而且還可進入血流，引起膿毒血癥。由于創(chuàng)面感染通常比較復雜，混合感染較為常見，?；祀s其他細菌，而且創(chuàng)口鮑特菌生長較為緩慢，很容易被其他細菌生長所掩蓋，不易發(fā)現(xiàn)。本研究從1例手部創(chuàng)傷患者的創(chuàng)面分泌物中培養(yǎng)出創(chuàng)口鮑特菌，且培養(yǎng)物較純，推測本例中分離到的創(chuàng)口鮑特菌可能具有一定的臨床意義，提示在實驗室分離到類似的少見菌，需要結合臨床，以及流行病學和實驗室檢測情況進行綜合分析。

根據(jù)細菌在血平板和麥康凱平板都生長的特點，初步判斷是革蘭陰性桿菌，革蘭染色證實該結果。細菌菌落形態(tài)較為特別，與常見的革蘭陰性桿菌有很大的區(qū)別，氧化酶試驗結果顯示為陽性。但也有文獻報道氧化酶試驗是陰性，其分析可能是檢測方法不一樣所致[6]。因此，此菌的氧化酶試驗有待進一步確定，通過生化反應的差異鑒定細菌是目前的主要方法。明確該菌為革蘭陰性桿菌后，研究人員立即采用梅里埃公司的革蘭陰性菌鑒定卡對該菌進行系統(tǒng)生化鑒定，鑒定結果為鮑特菌屬(置信度97%)。查閱具體生化反應，發(fā)現(xiàn)該菌只有5個生化項目為陽性反應，說明該菌生化反應并不活潑，有可能鑒定不準確，并且未能鑒定到具體的菌種水平，因此還需采用其他更好的檢測方法進行鑒定。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)是目前廣泛用于微生物鑒定的一種快速、可靠的檢測方法。Almagro-Molto等[7]研究發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOF MS可用于創(chuàng)口鮑特菌的鑒定。通過質譜鑒定出該菌為創(chuàng)口鮑特菌，其置信度高達99.9%。為進一步確保鑒定結果準確無誤，采取目前細菌鑒定準確度最高的分子生物學檢測技術對該菌進行鑒定和分析[8]。對該致病菌進行16S rRNA的PCR擴增及產物測序，經同源性分析，BLAST比對結果顯示其與創(chuàng)口鮑特菌的同源性為99.9%，確定鑒定結果是創(chuàng)口鮑特菌。在臨床工作中，遇到類似具有重要臨床意義的少見菌時，應充分利用目前的先進檢測技術，采用多種方法進行鑒定，確保結果準確無誤。

由于創(chuàng)口鮑特菌的感染主要發(fā)生在創(chuàng)面，臨床醫(yī)生通常會首先實施清創(chuàng)術，再配合使用抗菌藥物，以最大程度地減少感染的發(fā)生。合理的選擇抗菌藥物對預防創(chuàng)口鮑特菌感染十分重要。根據(jù)相關研究文獻報道，創(chuàng)口鮑特菌感染可常規(guī)使用環(huán)丙沙星和頭孢菌素。但研究[9-10]報道，已出現(xiàn)對頭孢他啶和環(huán)丙沙星耐藥的菌株。目前，CLSI并無針對創(chuàng)口鮑特菌的藥敏判斷折點，通常是按照腸桿菌目細菌的折點進行藥敏結果的判斷。本例中藥敏試驗結果顯示該菌對頭孢菌素均為耐藥，僅對亞胺培南、美羅培南和阿米卡星等少數(shù)藥物敏感，表明創(chuàng)口鮑特菌的耐藥性在逐漸發(fā)生變化。因此，臨床實驗室需要常規(guī)開展對該菌的藥敏試驗，加強對該菌的耐藥性監(jiān)測。

綜上所述，目前國內尚未見創(chuàng)面創(chuàng)口鮑特菌感染病例報道，結合近年來國外多例報道，提示臨床需重視創(chuàng)口鮑特菌感染，如果得不到及時控制，可能會引起膿毒血癥，危及患者生命。在實驗室鑒定方面，由于創(chuàng)口鮑特菌菌落形態(tài)特殊，且生化反應不活潑，臨床實驗室若分離到可疑菌株，應及時采用質譜鑒定或16S rRNA測序鑒定，以快速、準確獲得結果，并進行藥敏試驗，指導臨床用藥。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。