鄒羽彤 黃林生 鐘 慧 楊 蓉 谷 麗

1.安徽理工大學(xué)上海十院臨床學(xué)院（安徽淮南 232001）；2.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院（上海 200072）

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的慢性氣道疾病之一。近20余年來(lái)，我國(guó)兒童哮喘的患病率呈明顯上升趨勢(shì)[1-3]，嚴(yán)重影響兒童的身心健康。我國(guó)在2012 年—2013 年對(duì)10 個(gè)城市大型醫(yī)院的3 069 例哮喘兒童控制現(xiàn)狀的調(diào)查顯示，即使嚴(yán)格遵循哮喘全球防治創(chuàng)意（GINA）方案治療，仍有28.7%與45.0%的患兒未得到控制或部分控制[4]。因此，如何有效提高哮喘控制水平，對(duì)改善哮喘患兒的生活質(zhì)量，減輕其家庭以及社會(huì)負(fù)擔(dān)意義重大。目前越來(lái)越多的研究致力于探索新的方法來(lái)改變哮喘的控制現(xiàn)狀[5-6]。其中，腸道菌群的研究成為熱點(diǎn)領(lǐng)域。腸道菌群作為人體最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，除了影響腸道內(nèi)的微環(huán)境外，在人體免疫穩(wěn)態(tài)中也起到重要作用[7]。研究表明腸道菌群失調(diào)與哮喘的發(fā)生發(fā)展均密切相關(guān)[8-10]。本文擬通過(guò)研究不同控制水平哮喘患兒之間腸道菌群水平的差異，探討腸道菌群對(duì)哮喘患兒控制水平的影響，為微生態(tài)制劑在哮喘治療中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年1月至2020年12月于上海市第十人民醫(yī)院兒科門診診治并確診為哮喘的患兒為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合我國(guó)兒童支氣管哮喘診斷與防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)（2016 年版）[11]；②年齡10～12歲；③患兒具有良好的依從性，堅(jiān)持規(guī)律治療。隨機(jī)選取同期本院健康體檢兒童為對(duì)照組。對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡10～12歲；②體檢未見(jiàn)異常，且無(wú)哮喘及其他過(guò)敏性疾病史。各組排除標(biāo)準(zhǔn)：①不配合肺功能檢查、糞便檢測(cè)者；②近4周服用益生菌；③近4 周有呼吸系統(tǒng)感染及抗生素使用史；④合并除哮喘以外的慢性呼吸道疾??；⑤并發(fā)其他系統(tǒng)疾病如內(nèi)分泌疾病、肝腎功能不全、心血管疾病和自身免疫疾病等。

根據(jù)我國(guó)兒童支氣管哮喘診斷與防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，對(duì)哮喘患兒近4 周日間癥狀、夜間是否憋醒、應(yīng)急緩解藥使用頻率、活動(dòng)受限情況，進(jìn)行哮喘控制水平分級(jí)評(píng)估；存在1 項(xiàng)及以上癥狀歸入未控制/部分控制組，無(wú)以上任一癥狀歸入控制組。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（SHSY-IEC-4.0/19-175/01），所有受試者在研究開(kāi)始前簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 包括性別、年齡、身高、體質(zhì)量等一般臨床資料。

1.2.2 治療 所有患兒均依照我國(guó)兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[11]進(jìn)行治療，在入組前均接受沙美特羅替卡松粉霧劑（50ug/100ug）作為長(zhǎng)期治療藥物。治療時(shí)間為開(kāi)始規(guī)律用藥至入組當(dāng)天。

1.2.3 樣本采集 所有研究對(duì)象均在入組后當(dāng)天留取2g新鮮糞便樣本，置于可室溫保存的一次性大便樣本采集處理器中；在24h內(nèi)轉(zhuǎn)移至凍存管中收存，放入-80℃冰箱保存?zhèn)錅y(cè)。

1.2.4 肺功能檢測(cè) 所有研究對(duì)象入組當(dāng)天，由專業(yè)人員使用Medi-soft 肺功能檢測(cè)儀行肺功能檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）、第一秒用力呼氣量（forced expiratory volume in 1 second，F(xiàn)EV1）、FEV1/FVC、最大呼氣中段流量（maximal mid-expiratory flow，MMEF）、用力呼氣流速（forced expiratory flow，F(xiàn)EF）的FEF25、FEF50、FEF75。

1.2.5 糞便16 s rRNA 細(xì)菌檢測(cè) ①DNA 提取與擴(kuò)增：按照TIANamp stool DNA Kit糞便基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取糞便樣本中的DNA，而后行靶向PCR 擴(kuò)增，回收純化PCR 產(chǎn)物，進(jìn)行熒光定量，而后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求進(jìn)行相應(yīng)的比例混合。②高通量測(cè)序與分析：采用Illumina Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，后經(jīng)數(shù)據(jù)拆分、去引物序列、成對(duì)末端讀長(zhǎng)拼接、序列質(zhì)量及長(zhǎng)度過(guò)濾和截取以及去嵌合體后獲得最終的有效OTU（operational taxonomic unit）聚類分析數(shù)據(jù)?；贠TU聚類數(shù)據(jù)再對(duì)各個(gè)分類數(shù)據(jù)進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。③Alpha 多樣性指數(shù)：反映微生物群落的豐富度和多樣性，其中Observed otus指數(shù)是指樣本中實(shí)際測(cè)定得到的物種數(shù)量，Shannon指數(shù)用于衡量樣品中物種均勻度的指數(shù)，Pielou E指數(shù)的計(jì)算考慮到樣品中的分類總數(shù)和每個(gè)分類所占的比例，F(xiàn)aith pd指數(shù)基于系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)來(lái)計(jì)算的一種多樣性指數(shù)，它用各個(gè)樣品中OTU 的代表序列計(jì)算出構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的距離，將某一樣品中的所有代表序列的枝長(zhǎng)加和，從而得到數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的以中位數(shù)（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析Veillonella豐度對(duì)哮喘控制水平的預(yù)測(cè)價(jià)值。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

共入組哮喘患兒34例，過(guò)程中控制組有1例不配合肺功能檢查，未控制/部分控制組有1例近4周有抗生素使用史，2例不配合糞便采集。共4例患兒脫落，最終納入30例。

控制組16例，男10例、女6例，年齡（12.19±1.11）歲，身高（156.50±9.08）cm，體質(zhì)量（56.7±13.68）kg；未控制/部分控制組14例，男8例、女6例，年齡（12.92±1.59）歲，身高（159.64±14.11）cm，體質(zhì)量（58.46±18.25）kg；控制組中臨床緩解期12例，慢性持續(xù)期4例；未控制/部分控制組中慢性持續(xù)期14例。對(duì)照組12例，男6例、女6例，年齡（13.17±1.03）歲，身高（161.48±5.84）cm，體質(zhì)量（52.54±10.29）kg。三組間性別（χ2=0.80，P=0.804）、年齡（F=2.33，P=0.110）、身高（F=0.83，P=0.443）及體質(zhì)量（F=0.56，P=0.579）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。控制組治療時(shí)間為（1.22±0.18）年，未控制/部分控制組為（1.24±0.15）年，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.41，P=0.684）。

2.2 三組主要肺通氣功能檢測(cè)結(jié)果比較

三組間FVC、FEV1、FEV1/FVC、MMEF、FEF25、FEF75絕對(duì)值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。三組間FEF50絕對(duì)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），未控制/部分控制組較低。見(jiàn)表1。

表1 三組通氣功能指標(biāo)（絕對(duì)值）比較()

表1 三組通氣功能指標(biāo)（絕對(duì)值）比較()

2.3 腸道菌群的物種數(shù)量與Alpha多樣性比較

通過(guò)對(duì)42個(gè)糞便樣本的高通量測(cè)序分析，分析得到2 721個(gè)OTU，其中三組共有OTU數(shù)目1 289個(gè)，對(duì)照組特有257 個(gè)OTU，未控制/部分控制組特有198個(gè)OTU，控制組特有158個(gè)OTU（圖1a）。三組之間Alpha多樣性指數(shù)（4個(gè)指數(shù)）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 三組間腸道菌群測(cè)序的Alpha多樣性比較()

表2 三組間腸道菌群測(cè)序的Alpha多樣性比較()

通過(guò)對(duì)三組腸道菌群屬水平結(jié)構(gòu)組分分析發(fā)現(xiàn)，三組均主要由25個(gè)屬構(gòu)成。兩種菌屬均是腸道菌群的主要菌屬（圖1b），其中擬桿菌屬（Bacteroides）物種相對(duì)豐度控制組為29.61（27.13～36.11）%，未控制/部分控制組為30.22（26.88～48.19）%，對(duì)照組為27.43（20.82～33.99）%，三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=3.39，P=0.184）；糞桿菌屬（Faecalibacterium）物種相對(duì)豐度控制組為（20.05±10.10）%，未控制/部分控制組為15.55（11.15～21.28）%，對(duì)照組為（23.95±8.47）%，三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=3.36，P=0.186）。

圖1 腸道菌群豐度及物種差異分析

未控制/部分控制組中韋榮球菌屬（Veillonella）物種相對(duì)豐度為0.06（0.01～0.25）%，控制組為0.53（0.19～0.92）%，對(duì)照組為0.17（0.09～0.82）%，三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=9.03，P=0.011）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，未控制/部分控制組中Veillonella豐度較控制組以及對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

LEfSe 分析結(jié)果提示殊異韋榮菌（Veillonella.dispar）是控制組中的特征性菌屬，而戈登副擬桿菌（Parabacteroides.gordonii）是未控制/部分控制組的特征性菌屬（圖1c）。

2.4 Veillonella豐度對(duì)哮喘控制水平預(yù)測(cè)的ROC曲線分析

行ROC曲線分析可見(jiàn)，Veillonella豐度對(duì)哮喘控制水平預(yù)測(cè)的曲線下面積為0.82（95%CI：0.66～0.98，P=0.003）。取最佳臨界值點(diǎn)豐度為0.0018時(shí)，預(yù)測(cè)哮喘控制水平的特異性為28.6%，敏感度為86.7%。見(jiàn)圖2。

圖2 Veillonella 豐度預(yù)測(cè)哮喘控制水平的ROC 曲線分析

3 討論

哮喘長(zhǎng)期治療方案的制訂及調(diào)整以其控制水平為依據(jù)，可使患兒得到更充分的治療，從而達(dá)到并維持臨床控制[11]。近年來(lái)，我國(guó)兒童哮喘的規(guī)范化管理模式及治療手段在不斷改進(jìn)，也取得了一定的進(jìn)展，但是仍有不少患兒未能達(dá)到理想的治療目標(biāo)，兒童哮喘的總體控制水平有待進(jìn)一步提高[4,12]。達(dá)到癥狀的良好控制和維持正常肺功能是哮喘治療的主要目標(biāo)。小氣道因其自身細(xì)小且分支多的特點(diǎn)，是呼吸系統(tǒng)疾病中較早且容易被侵犯的部位，也是氣道高反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵部位[13]。有研究表明，較多哮喘患者存在小氣道受損，小氣道功能與氣道高反應(yīng)之間密切相關(guān)，與哮喘控制水平及遠(yuǎn)期預(yù)后都有著十分緊密的聯(lián)系[14-17]。本研究中，三組間通氣功能指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但未控制/部分控制組小氣道指標(biāo)FEF25、FEF50較對(duì)照組有下降趨勢(shì)，提示小氣道通氣功能障礙可能與哮喘控制不佳有關(guān)。因此，僅根據(jù)臨床癥狀以及肺通氣功能參數(shù)FEV1、FEV1/FVC 而判斷哮喘控制，易忽視患兒小氣道功能障礙的情況，可能導(dǎo)致未來(lái)哮喘控制不良，進(jìn)而影響哮喘兒童的遠(yuǎn)期預(yù)后。

腸道菌群作為腸道免疫系統(tǒng)的重要刺激因素，通過(guò)機(jī)體局部或全身免疫應(yīng)答反應(yīng)等多種途徑調(diào)節(jié)免疫平衡，促進(jìn)腸黏膜相關(guān)淋巴組織的成熟，增強(qiáng)腸黏膜的屏障功能。腸道菌群的構(gòu)成與過(guò)敏性疾病的發(fā)生有關(guān)，腸道菌群的改變可引起肺部免疫和肺部疾病的變化[18]。腸道微生物群可通過(guò)產(chǎn)生細(xì)菌配體、細(xì)菌代謝物和能夠通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)肺部的免疫細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)肺免疫[19-20]。一些研究顯示，成人哮喘患者與健康人群的腸道菌群之間雖沒(méi)有顯著差異，但存在一些產(chǎn)丁酸鹽的特異性菌屬，可能在癥狀早期控制中發(fā)揮作用[21]。

人體的腸道主要菌群是擬桿菌門與厚壁菌門，本研究中哮喘控制組的特征菌屬Veillonella是一類以利用有機(jī)酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)生乙酸鹽、丙酸鹽為主的革蘭陰性厭氧微小球菌，屬于厚壁菌門，參與構(gòu)成人和動(dòng)物的口腔、泌尿生殖器、呼吸道及腸道內(nèi)的正常菌群。一項(xiàng)來(lái)自加拿大的縱向研究顯示，哮喘高風(fēng)險(xiǎn)的嬰兒腸道中韋榮球菌（Veillonella）、糞腸球菌（Faecalis）、毛螺菌（Lachnospira）、羅氏菌（Rothia）的相對(duì)豐度顯著降低[9]。在進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，這四種菌的腸道定植也明顯改善了無(wú)菌小鼠的氣道炎癥[22]，但哮喘的高危兒童是否可通過(guò)早期補(bǔ)充這些益生菌來(lái)改善哮喘的控制水平，仍有待臨床證實(shí)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)1 歲時(shí)糞便中丁酸鹽和丙酸含量高的兒童在3～6歲患哮喘的可能性也較小，而在小鼠哮喘模型中補(bǔ)充短鏈脂肪酸可減輕其氣道炎癥反應(yīng)[23-25]。有研究表明，在出生后第一年補(bǔ)充特定的微生物制劑對(duì)哮喘高危兒童來(lái)說(shuō)具有一定益處[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充益生菌輔助治療支氣管哮喘，可調(diào)節(jié)患兒免疫功能，降低哮喘復(fù)發(fā)率[26]。值得注意的是，目前多為腸道菌群與哮喘發(fā)病機(jī)制之間的相關(guān)性研究，而腸道菌群對(duì)哮喘控制水平影響的研究較少。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，單一或復(fù)合益生菌（如鼠李糖乳桿菌、雙歧桿菌、副乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌等）在哮喘的防治中具有一定的輔助效果[27-29]，雖然其機(jī)制尚不明確，但是提示腸道菌群可能在一定程度上可影響哮喘患者的控制水平。本研究提示控制不佳的哮喘患兒腸道菌群特征性菌屬Veillonella豐度明顯減少，可能與哮喘控制水平具有一定的相關(guān)性。但具體影響途徑，是通過(guò)減少對(duì)有機(jī)酸的分解轉(zhuǎn)化或是腸道菌群紊亂促進(jìn)促炎因子轉(zhuǎn)錄[30]亦或是其他通路，現(xiàn)有研究并無(wú)法確定。該研究為哮喘兒童的長(zhǎng)期控制治療可能提供了一種新思路，通過(guò)補(bǔ)充優(yōu)勢(shì)菌群的微生物制劑或進(jìn)行優(yōu)勢(shì)菌群移植來(lái)調(diào)節(jié)或改善哮喘患兒的腸道菌群紊亂，以達(dá)到控制哮喘水平的目的；為哮喘的臨床治療提供了可能性，但仍需對(duì)腸道菌群與哮喘發(fā)病機(jī)制的影響進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，控制不佳的哮喘兒童腸道菌群中Veillonella豐度明顯減少，相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究深入。本研究仍存在一定的不足之處，首先納入的樣本量較少，入組患兒均未處于急性發(fā)作期，主要通氣功能結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能存在單中心偏倚，試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步增加樣本量來(lái)論證；其次，本研究采用16 s rRNA 的檢測(cè)方式，對(duì)未控制/部分控制組的特征性菌屬并沒(méi)有更深入的分析，使用更精確的檢測(cè)技術(shù)分析或許會(huì)得到更好的結(jié)果；第三，本研究?jī)H檢測(cè)了單節(jié)點(diǎn)的患兒腸道菌群，還需對(duì)臨床入組人群進(jìn)行腸道菌群動(dòng)態(tài)追蹤和分析，或哮喘規(guī)范治療前后腸道菌群比較。也期待大樣本、多中心的臨床研究做進(jìn)一步的論證，為臨床兒童哮喘的防治提供新的思路。