付 瑤，孔凡林，齊志國，王 俊，Elnazeir Mohammed Dawelbait，郭江鵬，蔣林樹

（1.北京市畜牧總站，北京 100107；2.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，北京 100081；3.北京農(nóng)學院動物科技學院，奶牛營養(yǎng)學北京市重點實驗室，北京 102206）

微量元素硒的卓越抗氧化特性使得富硒畜禽產(chǎn)品的開發(fā)成為當前研究的熱點之一。硒是富硒乳開發(fā)的核心成分，它不僅對奶牛的免疫功能等有積極作用，而且對維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定同樣重要。飼料中常采用無機硒和有機硒2 種方式進行補硒。因無機硒存在潛在毒性且生物利用率低，實際生產(chǎn)中更傾向于使用有機硒。酵母硒為常見的有機硒源，其活性成分主要為蛋氨酸硒，但酵母硒的生物利用效率不高。高羊毛氨酸硒（Selenohomolanthionine，SeHLan）是一種新型的有機硒來源，于2007 年在添加了硒酸鹽的日本辣蘿卜提取物中被發(fā)現(xiàn)，隨后，在硒化酵母提取物中鑒定出其衍生物，被學者認為是硒的一種潛在補充來源。與傳統(tǒng)的硒代蛋氨酸（SeMet）型酵母硒相比，SeHLan 組成更穩(wěn)定，且從代謝途徑上來看，它只作為硒源被機體識別，生物利用效率更高。

瘤胃是反芻動物獨特的消化器官，瘤胃內(nèi)豐富的微生物通過代謝富硒飼糧中的硒影響其生物利用率，同時影響著瘤胃內(nèi)環(huán)境。相反，硒也會影響某些瘤胃微生物的生長繁殖。科學、合理使用硒并發(fā)揮其對反芻動物瘤胃的作用意義重大。本試驗旨在研究SeHLan 和亞硒酸鈉（Sodium Selenite，SS）對泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃發(fā)酵及瘤胃微生物區(qū)系的影響，為更好地評估2 種硒源對奶牛的影響提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及飼糧 試驗采用完全隨機設計。選用健康的泌乳日齡（181±18）d、日產(chǎn)奶（33.88±3.44）kg/d、（3.25±1.27）胎的荷斯坦泌乳奶牛32 頭，分為2 組，分別飼喂添加SS、SeHLan 的2 種全混合日糧（TMR），每組16 頭?；A飼糧根據(jù)奶牛體重和營養(yǎng)需要，參照《奶牛飼養(yǎng)標準》（NY/T 34-2004）配制，預混料無外源硒，基礎飼糧組成及營養(yǎng)成分見表1。SS 為分析純化學試劑，SeHLan 由聯(lián)英管理（上海）有限公司提供，硒的添加量為15 mg/（d·頭）。SS 組、SeHLan 組飼糧中硒含量實測值（干物質(zhì)基礎）分別為0.47 mg/kg 和0.46 mg/kg。預試期2 周，正試期9 周。奶牛每天飼喂2 次（07:00和19:00），自由采食、飲水，每天早中晚擠奶3 次。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎）

1.2 樣品采集 試驗結(jié)束前的最后一天，每組選取6 頭體況良好且健康的奶牛，在晨飼后4 h 通過口腔真空抽取瘤胃液，棄去開始的部分，避免口腔唾液的影響。測定瘤胃液pH 后，經(jīng)4 層紗布過濾，一部分分裝在50 mL離心管中，于-20℃冰箱保存用以測定氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸（VFA），一部分分裝在2 mL 凍存管中，于液氮中保存用以測定瘤胃微生物區(qū)系情況。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 瘤胃發(fā)酵指標 采用UB-7 pH 計（美國丹佛儀器公司生產(chǎn)）測定瘤胃液pH。采用Broderick 等文獻中的靛酚藍-分光光度法，使用UV-1601 型紫外可見分光光度計測定瘤胃液氨態(tài)氮濃度。采用Erwin 等文獻中的氣相色譜分析法，使用TP-2060 型氣相色譜儀測定瘤胃液VFA 濃度。

1.3.2 瘤胃微生物多樣性

1.3.2.1 DNA 提取和檢測 按照天根生化科技（北京）有限公司的DNA 提取試劑盒說明書提取基因組DNA，使用NanoDrop2000（Thermo Scientific，MA，USA）對DNA 的濃度和純度進行檢測。

1.3.2.3 擴增及測序 用帶有barcode 的特異引物擴增16S rDNA 的V3-V4 可變區(qū)。引物序列：338F（5'-ACTC CTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3'）。然后將PCR 擴增產(chǎn)物切膠回收，用QuantiFluor-ST 藍色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進行檢測定量。將純化的擴增產(chǎn)物進行等量混合，連接測序接頭，構(gòu)建Miseq 測序文庫。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進行測序。

1.4 統(tǒng)計分析 使用FLASH 軟件對reads 進行拼接，通過Uparse 軟件將相似性≥97%的序列聚類到同一OTU（Operational Taxonomic Unit，操作單元）并進行注釋，使用QIME 軟件計算微生物群落多樣性，使用R 軟件（vision 3.2.2）計算樣品間UniFrac 距離，分析微生物群落多樣性。

其他試驗數(shù)據(jù)用Excel 進行初步整理，采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，處理之間差異顯著性通過檢驗進行比較，計算標準誤（SEM）和值。以＜0.05 表示差異顯著，＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 SS、SeHLan 對奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 由表2可知，瘤胃液pH、氨態(tài)氮濃度、各酸的比例、乙酸/丙酸、總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）均不受硒源的影響（＞0.05），且2 組奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)均在正常范圍內(nèi)。

表2 SS、SeHLan 對奶牛瘤胃發(fā)酵的影響

2.2 SS、SeHLan 對奶牛瘤胃微生物群落的影響

2.2.1 SS、SeHLan 對奶牛瘤胃微生物多樣性的影響利用QIME 軟件對微生物OTUs 進行多樣性分析，包括Sobs 指數(shù)、PD whole tree 指數(shù)、Pielou 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)。由表3 可知，各組文庫覆蓋率均在99%以上，說明每個樣品測序量合理，可以很好地反映瘤胃微生物群落種類和結(jié)構(gòu)多樣性。Sobs 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、PD whole tree 指數(shù)、Pielou 指數(shù)及Shannon 指數(shù)在兩組間均無顯著差異，說明采食SS 和SeHLan 飼糧的奶牛瘤胃微生物存在相似的豐富度、均勻度及多樣性。

表3 SS 和SeHLan 對奶牛瘤胃微生物多樣性指數(shù)的影響

2.2.2 瘤胃中細菌群落相似性 由PLS-DA 分析表明（圖2），其第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為13.40% 和14.05%，采食SS 和SeHLan 組飼糧奶牛的瘤胃液樣本可以明顯區(qū)分并聚成2 個類群，說明瘤胃液樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。

圖2 SS 和SeHLan 飼糧對應的瘤胃液中細菌群落主成分分析

2.2.3 瘤胃中細菌群落結(jié)構(gòu)在門和屬水平上的變化 在2 組奶牛的瘤胃微生物中鑒定出了18 個門，其中13 個門為全部樣本所共有，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、糖化菌門（Saccharibacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、SR1_ 棘手螢菌門（SR1_Absconditabacteria）、螺旋菌門（Spirochaetae）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、藍藻菌門（Cyanobacteria）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）以及一種未知菌門。在這些門中，豐度占比大于1%的為Firmicutes、Bacteroidetes、Saccharibacteria、Actino bacteria、Proteobacteria 和Tenericutes，平均豐度分別為59.0%、34.6%、1.63%、1.16%、1.03% 和1.01%。由表4 可知，各組優(yōu)勢菌群間無顯著差異。

表4 SS 和SeHLan 對奶牛瘤胃門水平微生物的影響 %

通過屬水平微生物組成分析，在屬水平上鑒定出227 個細菌群落，并且在所有樣品中存在100 個屬，這些屬水平細菌屬于核心微生物組。高豐度群有普雷沃氏菌屬_1（）（17.49%）、解琥珀酸菌屬（）（10.93%）、瘤胃球菌科 NK4A214群（）（6.41%）、瘤胃球菌屬_2（）（3.44%）、毛螺菌科NK3A20 群（）（3.33%）、克里斯滕森菌科R-7 群（）（3.05%）、瘤胃球菌科_UCG-014 屬（）（2.92%）、瘤胃球菌屬_1（）（2.27%）、普雷沃氏菌屬_7（）（2.15%）、丁酸弧菌屬_2（）（2.04%）、反芻真桿菌群（[]_）（1.66%）、糖化假絲酵母菌屬（）（1.63%）、普雷沃氏菌科_UCG-001 屬（）（1.54%）、理研菌科_RC9 群（）（1.52%）、瘤胃球菌科_UCG-005 屬（）（1.40%）、產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬（）（1.18%）、產(chǎn)糞甾醇真細菌群（[]_）（1.03%）、毛螺菌科_AC2044 群（）（1.01%）。2 組的優(yōu)勢菌屬均為和，但其含量兩組間差異不顯著。

如表5 所示，2 組的顯著差異性細菌有2 種。SeHLan組中高于SS 組（＜0.05），SeHLan組中低于SS組（＜0.05）。

表5 SS 和SeHLan 對奶牛瘤胃屬水平微生物的影響 %

3 討 論

3.1 SS、SeHLan 對奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 瘤胃健康和牛體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定對奶牛的生長發(fā)育具有重要意義。瘤胃液pH、氨態(tài)氮濃度及VFA 含量可以反映瘤胃發(fā)酵情況。奶牛瘤胃液pH 的正常范圍為5.5～7.5，當pH 小于6.2 時，將會抑制纖維分解菌的活動。本研究中，SS 組和SeHLan 組瘤胃液pH 分別為6.38 和6.39，適宜瘤胃微生物的活動。VFA 來自于飼糧中碳水化合物的發(fā)酵，是碳水化合物分解的終物質(zhì)，也是反芻動物維持和生產(chǎn)的主要養(yǎng)分和能量來源，可為反芻動物供給總能量的70%～80%。研究表明，飼糧中添加酵母硒或納米硒可顯著增加瘤胃丙酸含量，且顯著降低乙酸/丙酸。但也有研究并未發(fā)現(xiàn)酵母硒對丙酸含量或乙酸/丙酸有顯著影響。本研究結(jié)果也表明，與添加SS相比，SeHLan 對VFA 含量及乙酸/丙酸無顯著影響，說明不同硒源并未對瘤胃發(fā)酵模式產(chǎn)生顯著影響。試驗結(jié)果的不同可能與硒的添加量、動物品種等不同有關。氨態(tài)氮是瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成的主要氮源，微生物對飼糧蛋白質(zhì)的利用率隨微生物活性的增加而增加。本試驗中，SS 組和SeHLan 組氨態(tài)氮的濃度沒有顯著差異，且在正常值范圍內(nèi)（2.50～11.74 mg/dL），說明添加2種硒源未對瘤胃微生物菌群活躍度產(chǎn)生負面影響。

3.2 SS、SeHLan 對奶牛瘤胃微生物群落的影響 本研究中，Chao1 指數(shù)（反映微生物群落的相對豐度）、Sobs 指數(shù)（為觀測的OTU 數(shù)目）及PD whole tree 指數(shù)（反映譜系多樣性）變化趨勢相近，未見顯著差異，說明飼喂2 種硒源的奶牛瘤胃微生物具有相似的物種豐富度。本試驗未觀察到2 組Pielou 指數(shù)（反映群落均勻度）顯著差異。Shannon 指數(shù)綜合考慮了群落的豐富度和均勻度，Shannon 指數(shù)越大，代表樣本均一性越好。本試驗該指數(shù)在兩組間無顯著差異，說明兩組間存在相似的均一性。

Firmicutes 和Bacteroidetes 是2 種硒源條件下奶牛的主要細菌菌門，F(xiàn)irmicutes 可以降解纖維和纖維素，Bacteroidetes 有助于消化碳水化合物并發(fā)酵有機物質(zhì)。本研究中兩者占比超過92%，與前人研究結(jié)果一致。在屬水平上，占比最高，其次是，兩者占比超過30%，與前人研究結(jié)果一致。本試驗中，2 種硒源對Firmicutes 和Bacteroidetes、和的豐度均無顯著影響。SS、SeHLan 進入瘤胃后的代謝途徑不盡相同。其中，SS 一部分用于瘤胃菌體蛋白的合成，一部分被還原為不溶的硒及硒化物，一部分以亞硒酸鹽的形式離開瘤胃；而SeHLan 一部分用于瘤胃菌體蛋白的合成，一部分以硒半胱氨酸的形式離開瘤胃。同時，學者發(fā)現(xiàn)來自變形菌門和厚壁菌門的至少15 個屬的微生物（如莢膜紅細菌、熒光假單胞菌等）具有將硒降解為難吸收物質(zhì)的作用。在本研究中并未發(fā)現(xiàn)2 種硒源對硒還原和含硒蛋白合成的微生物具有顯著影響，這可能是由于本研究中飼喂2 種硒源未對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生顯著影響，同時與在瘤胃內(nèi)發(fā)酵依靠特定種類微生物的飼糧營養(yǎng)成分組成相似有關。

為潛在有益菌，與纖維降解密切相關，在瘤胃內(nèi)可產(chǎn)生纖維酶降解纖維二糖等纖維類物質(zhì)，是一類典型的纖維降解菌，其含量的增加可以提高纖維消化率，與飼糧中性洗滌纖維的消化率顯著相關。SeHLan 可以提高中性洗滌纖維的表觀消化率。同時，研究也證實具有免疫調(diào)節(jié)的作用。本試驗中，SeHLan 組含量顯著高于SS組，推測SeHLan 組具有更好的提高奶牛免疫力的作用。在臨床上作為免疫、結(jié)腸炎鑒定的標志微生物，其豐度越高表示免疫力或抗病性越低。本試驗中SeHLan 組顯著低于SS 組，因而推測SeHLan 對提高奶牛免疫力或抗病性的作用更好。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，與添加SS 相比，飼糧中添加SeHLan 未對泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃發(fā)酵類型產(chǎn)生顯著影響；二者對瘤胃微生物豐富度以及主要優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬無顯著影響，但在屬水平上檢測到2 種具有顯著差異的功能性細菌和。